层析分离技术课件

层析分离技术层析分离技术14层析分离技术概述吸附层析凝胶过滤层析离子交换层析亲和层析反相层析疏水作用层析4层析分离技术概述24.1概述层析，又称色谱（chromatography），是一类分离分析方法，利用混合物中各组分理化性质（分子大小、吸附性质、电荷、极性、生物学亲和力等）的差异，使各组分以不同程度分布在固定相和流动相，因而随流动相移动速度存在差异而得以相互分离。特点：分离效率高，能分离性质极其类似的物质；既可用于少量物质的分析鉴定，又可用于大量物质的分离制备。4.1概述层析，又称色谱（chromatography），34.1.1基本概念固定相是层析的基质，可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在滤纸、硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用，对层析的效果起关键的作用。4.1.1基本概念固定相4（二）金属的物理性质:①常温下，单质都是固体，汞(Hg)除外；②大多数金属呈银白色，有金属光泽，但金(Au)——色，铜(Cu)——色，铋(Bi)——色，铅(Pb)

色。

黄红微红

蓝白③不同金属熔点、硬度差别较大；（二）金属的物理性质:①常温下，单质都是固体，汞(Hg)除外5④良好的导电性，分析原因：金属中存在着大量的可自由移动的电子。⑤良好的导热性，分析原因：通过自由电子和金属阳离子的相互碰撞传递热量。⑥良好的延展性。金铂⑦金属单质在化学反应中只作还原剂，在化合物中金属元素只显正价。④良好的导电性，分析原因：金属中存在着大量的可自由移6（二）、金属的物理性质合金：概念：两种或两种以上的金属（或金属与非金属）熔合而成的具有金属特性的物质。性质：具备金属特性(光泽、热电良导体、延展性等)。 熔沸点一般低于组分单质；硬度一般比组分单质大。

（二）、金属的物理性质合金：7（三）、金属的化学性质

金属原子易失去价电子成为阳离子，因而表现出较强的还原性。由于不同的金属原子结构、原子半径的不同，表现的还原性也有强弱不同。(1)与O2反应KCaNa

MgAl

ZnFeSnPb（H）CuHg

AgPtAu常温迅速

成膜加热

加热能反应不反应（三）、金属的化学性质金属原子易失去价电子成为阳离子，因而8(2)与H2O反应

KCaNa

MgAl

ZnFeSnPb

……条件：冷水剧烈热水缓慢水蒸气高温不反应产物：氢氧化物和氢气氧化物和氢气(3)与酸反应KCaNaMgAlZnFeSnPb

CuHgAg

PtAu

常温下与非氧化性酸反应氧化性酸王水(4)置换反应(5)特例：2Al+2NaOH+2H2O=2NaAlO2+3H2(2)与H2O反应9金属活动性顺序的应用KCaNaMgAlMnZnFeNiSnPbHCuHgAgPtAu判断金属的活动性顺序。判断金属与酸溶液反应的激烈程度等情况。判断金属单质还原性强弱。判断金属低价阳离子的氧化性强弱。判断金属金属性的强弱顺序。判断原电池的正负极。判断和水、氧气反应条件以及产物。判断相同浓度相同阴离子溶液的酸碱性强弱顺序。判断电解时阳离子和金属电极的放电顺序。判断金属单质的制备方法。金属活动性顺序的应用KCaNaMgAlMnZn10一、碱金属和碱土金属的概述二、碱金属和碱土金属的性质与用途三、碱金属和碱土金属的氧化物、氢氧化物及盐类第二节碱金属和碱土金属一、碱金属和碱土金属的概述第二节碱金属和碱土金属11一、碱金属和碱土金属的概述

IAIIALiBeNaMgKCaRbSrCsBa原子半径减小金属性、还原性减弱电离能、电负性增大原子半径增大金属性、还原性增强电离能、电负性减小价层电子构型：IA、IIA，一、碱金属和碱土金属的概述

原子半径减小价层电子构型：IA12均以矿物形式存在:钠长石:钾长石:光卤石:明矾石:锂辉石:绿柱石:菱镁矿:石膏:萤石天青石:重晶石:大理石:元素的存在均以矿物形式存在:绿柱石:菱镁矿:萤石天青石:大理石:元素的13流动相指在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体或超临界体等。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。它也是层析分离中的重要影响因素之一。流动相14迁移率Rf

指在一定条件下，在相同的时间内某一组分在固定相移动的距离与流动相本身移动的距离之比值。迁移率的差异程度往往是决定几种物质采用层析方法能否分离的先决条件。迁移率Rf15分辨率Rs

是用来描述两种物质之间分离效果的好坏参数，其定义是两个洗脱峰峰顶对映的洗脱体积之差比上两峰在基线上峰宽的和的平均值。分辨率Rs16主体分离基线分离不同Rs下的分离效果主体分离基线分离不同Rs下的分离效果174.1.2层析法的分类根据固定相基质的形式分类分为纸层析、薄层层析和柱层析。根据流动相的形式分类分为液相层析和气相层析。根据分离的原理不同分类分为吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水作用层析、反相层析、亲和层析等。4.1.2层析法的分类根据固定相基质的形式分类184.2吸附层析吸附层析（AdsorptionChromatography）是以吸附剂为固定相，根据待分离物与吸附剂之间吸附力不同而达到分离目的的一种层析技术。按吸附剂和吸附物之间的作用力不同，吸附可分为三种类型：物理吸附：范德华力，吸附解吸速度快，选择性较差化学吸附：生成化学键，达到平衡慢，选择性较好交换吸附：极性分子或离子之间发生交换吸附…….4.2吸附层析吸附层析（AdsorptionChroma19常用吸附剂按其化学结构可分两类有机吸附剂，如：活性炭、纤维素、大孔吸附树脂、聚酰胺等无机吸附剂，如：硅胶、氧化铝、硅酸镁、硅藻土、羟基磷灰石等常用吸附剂按其化学结构可分两类20常用吸附剂简介硅胶是一种极性吸附剂，又是一种弱酸性阳离子交换剂，其表面上的硅醇基能释放弱酸性的氢离子，遇较强碱性化合物，则可因离子交换反应而吸附碱性化合物；应用于萜类、固醇、生物碱、酸性化合物、磷脂、脂肪、氨基酸等的吸附分离。常用吸附剂简介硅胶21氧化铝对于分离一些碱性中草药成分，如生物碱类颇为理想；用稀硝酸或稀盐酸处理氧化铝，不仅可中和含有的碱性杂质，并可使颗粒表面带有阴离子，具离子交换剂的性质，适合于酸性成分的层析，这种氧化铝称为酸性氧化铝；经不同的处理还可得到中性氧化铝或碱性氧化铝，它们分别适用于不同物质的分离。氧化铝22活性炭是使用较多的一种非极性吸附剂。一般选用颗粒活性炭，主要用于分离水溶性成分，如氨基酸、糖类及某些甙。活性炭的吸附作用，在水溶液中最强，在有机溶剂中则较低。故水的洗脱能力最弱，而有机溶剂则较强。活性炭23羟基磷灰石（hydroxyapatite,HA）HA材料特点羟基磷灰石的晶体结构

多孔球形羟基磷灰石颗粒羟基磷灰石（hydroxyapatite,HA）羟基磷灰24HA的吸附机理HA机理的主要观点是：HA的Ca2+和生物分子表面的负电荷基团的结合，对生物分子的分离起重要作用；而HA的磷酸基团与生物分子表面的正电荷基团的结合，则起次要作用。HA的吸附机理25大孔吸附树脂特点大孔型颗粒，其孔隙、骨架结构和极性可按需要选不同的原料和合成条件而改变；借助范德华力吸附有机物质，不受无机盐干扰；解吸容易、机械强度好、可反复使用。应用：适用于对水中溶解度不大而较易溶于有机溶剂的活性物质提取分离，如维生素B12、四环素、土霉素等，还可用于污水处理、糖浆脱色等。大孔吸附树脂26大孔吸附树脂的选择和使用选择依据：吸附剂及吸附物的极性一般来说，非极性吸附剂易从极性溶剂中吸附非极性物质；极性吸附剂易从非极性溶剂中吸附极性物质；中等极性的吸附剂对上述两种情况都具有吸附能力。吸附物质的大小吸附物分子较大的，应选择大孔树脂中孔径大的。大孔吸附树脂的选择和使用选择依据：27吸附层析的分离效果，决定于吸附剂、溶剂、被分离化合物的性质及吸附条件等因素。

吸附层析的分离效果，决定于吸附剂、溶剂、被分离化合物的性质及28吸附剂的性质吸附剂的比表面积、颗粒度、孔径、极性对吸附的影响很大。比表面积越大，空隙度越高，吸附容量越大；而颗粒度越小，吸附速度就越快。一般要吸附相对分子量大的，要选择孔径大的吸附剂；吸附相对分子量小的则选择比表面积高及孔径小的。吸附剂的性质吸附剂的比表面积、颗粒度、孔径、极性对吸附的影响29极性吸附剂层析时，当被分离物质为弱极性物质，一般选用弱极性溶剂为洗脱剂；被分离物质为强极性成分，则须选用极性溶剂为洗脱剂。而对非极性吸附剂，如活性炭，则正好与上述顺序相反。洗脱剂（溶剂）极性吸附剂层析时，当被分离物质为弱极性物质，一般选用弱极性溶30被分离物质的性质在指定的吸附剂与洗脱剂的条件下，各个成分的分离情况，直接与被分离物质的结构与性质有关。被分离物质的性质在指定的吸附剂与洗脱剂的条件下，各个成分的31吸附条件温度：吸附一般是放热的，升高温度会使吸附量降低；蛋白质或酶类的吸附却往往是吸热的，升高温度会使吸附量提高，但需注意热稳定性。pH：溶液的pH往往会影响吸附剂或吸附物的解离情况，进而影响吸附量，一般需通过具体实验来确定。盐的浓度：影响比较复杂，对不同物质不同，需要考察后确定。吸附条件温度：吸附一般是放热的，升高温度会使吸附量降低；蛋白324.3凝胶过滤层析概述凝胶过滤层析基本理论凝胶过滤介质凝胶过滤层析实验技术应用举例4.3凝胶过滤层析概述334.3.1概述凝胶过滤层析gelfiltrationchromatography

亦称分子筛层析

molecularsievechromatography

凝胶渗透层析

gelpermeationchromatography

分子排阻层析

molecularexclusionchromatography4.3.1概述凝胶过滤层析gelfiltration34是利用具网状结构的凝胶的分子筛作用，据被分离物的分子大小不同来进行分离优点分离条件温和样品回收率高实验的重复性高操作时间短，设备简便经济是利用具网状结构的凝胶的分子筛作用，据被分离物的分子大小不同35层析分离技术课件36层析分离技术课件374.3.2凝胶过滤层析基本理论4.3.2.1凝胶过滤层析基本原理凝胶颗粒具三维网状结构，可对大小不同的分子流动产生不同的阻滞作用颗粒粒径几十到几百μm

间隙几到几十μm

孔隙的孔径nm级（一般大分子也在nm级）4.3.2凝胶过滤层析基本理论4.3.2.1凝胶过滤层析38层析分离技术课件39待分离物质按分子大小分为三类A类：dA＞最大孔径，全排阻（出），凝胶对它无阻滞，最早流出；C类：dC＜最小孔径，能进入全部孔隙区，阻滞最大，流速最慢，最晚流出；B类：最小孔径＜dB＜最大孔径，进入部分孔隙区，大小不同B类分子之间阻滞不同，可以分离把B类分子的分离称为分级分离；把A、B、C类分子间分离称为组别分离待分离物质按分子大小分为三类A类：dA＞最大孔径，全排阻（出404.3.2.2凝胶过滤柱的有关参数（1）凝胶的参数排阻极限用A类分子中最小分子量表示工作（分级）范围实际是B类分子的分子量范围

4.3.2.2凝胶过滤柱的有关参数（1）凝胶的参数41（2）

凝胶床流动相—间隙液体固定相—孔隙液体洗脱剂：往往是具有一定pH、盐浓度的缓冲液洗脱液：从柱下流出的含有溶质的洗脱剂床高（H或L）床直径（D）沉积表面（床面）凝胶底板（2）

凝胶床流动相—间隙液体沉积表面（床面）凝胶底板42总床体积Vt由凝胶骨架体积、孔隙内液体体积和凝胶颗粒间隙液体体积三部分组成外水体积V0：间隙液体体积内水体积Vi：凝胶孔隙内液体体积凝胶（溶胀）体积VX=Vt-V0=Vi+Vg凝胶骨架（干胶）体积Vg=VX-Vi总床体积Vt由凝胶骨架体积、孔隙内液体体积和凝胶颗粒间隙液43（3）凝胶过滤中溶质运动的特征洗脱体积VeVe与样品体积VS有关，分三种情况：VS与Vt相比可以忽略VS不能忽略VS很大洗脱曲线出现平台（3）凝胶过滤中溶质运动的特征洗脱体积Ve44凝胶过滤层析中三类分子洗脱情况组分A为全排阻分子，组分B为部分渗透分子，组分C为全渗透分子凝胶过滤层析中三类分子洗脱情况组分A为全排阻分子，组分B为部45分配系数KdA类分子Kd=0Ve=V0C类分子Kd=1Ve=Vi+V0B类分子0<Kd<1Ve=Vi.Kd+V0Kd<0装柱不好，发生沟流（短路）；Kd>1凝胶对溶质分子可能有吸附作用分配系数KdKd<0装柱不好，发生沟流（短路）；Kd>146在Kd的表达式中，Vi

较难测定，于是提出了有效分配系数Kav在Kd的表达式中，Vi较难测定，于是提出了有效分配系数Ka47溶质分子量与Kd的关系－－选择性曲线

在分级范围内，不同凝胶b,c值不同10KdlogMCBA

工作范围（分级范围）Kav-logM曲线及Ve/V0-logM,Ve-logM曲线称为相对洗脱曲线溶质分子量与Kd的关系－－选择性曲线10KdlogMC484.3.3凝胶过滤介质Gel的定义：含大量液体的具三维网状开孔弹性结构的多聚体结构。（一般制成球状颗粒）层析用凝胶的要求:⑴多孔、孔隙区大，Vi

要大⑵亲水⑶惰性⑷稳定⑸层析性能好4.3.3凝胶过滤介质Gel的定义：含大量液体的具三维网状494.3.3.1交联葡聚糖凝胶（Sephadex）骨架：葡聚糖（dextran）主链：α-1,6-糖苷键（约95%）分支：α-1,3-糖苷键（约5%）交联剂：环氧氯丙烷以醚键交联*控制葡聚糖与交联剂比例可制造不同孔径凝胶

G-X可表示型号，X从10~200

（其数字表示10g干胶的吸水量ml）4.3.3.1交联葡聚糖凝胶（Sephadex）骨架：葡聚50Sephadex的局部结构环氧氯丙烷Sephadex的局部结构环氧氯丙烷51SephadexG系列凝胶的类型和部分性质Sephadex型号水化颗粒直径m得水值ml/g干胶床体积ml/g干胶分级范围pH稳定范围葡聚糖球状蛋白G-1055~1661.0±0.12~3<7×102<7×1022~13G-1560~1811.5±0.22.5~3.5<1.5×103<1.5×1032~13G-25粗172~5162.5±0.24~61×102~5×1031×103~5×1032~13G-25中86~256G-25细34~138G-25超细17~69G-50粗200~6065.0±0.39~115×102~1×1041.5×103~3×1042~10G-50中101~303G-50细40~60G-50超细20~80G-7592~2777.5±0.512~151×103~5×1043×103~8×1042~10G-75超细23~923×103~7×104G-100103~31010.0±1.015~201×103~1×1054×103~1.5×1052~10G-100超细26~1034×103~1×105G-150116~34015.0±1.520~301×103~1.5×1055×103~3×1052~10G-150超细29~11618~225×103~1.5×105G-200129~38820.0±2.030~401×103~2×1055×103~6×1052~10G-200超细32~12920~255×103~2.5×105SephadexG系列凝胶的类型和部分性质Sephade52稳定性化学稳定性较稳定…，其稳定pH范围为2～12

强酸下，凝胶糖苷键易水解；强碱下，羟基易氧化成酸一般稀碱下相对稳定，可用于清洗物理稳定性

对热较稳定，可进行高温灭菌耐压性与凝胶型号有关稳定性53层析性能总工作范围：分子量100～60万吸附作用离子性芳香性（疏水）层析性能54SephadexG类型凝胶的选择性曲线SephadexG类型凝胶的选择性曲线554.3.3.2琼脂糖凝胶商品名因生产厂家不同而异，最常见的是Sepharose和Bio-GelA结构β-D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖交替结合所形成的线性多聚糖糖浓度越大，网孔越小型号：Sepharose2B、4B、6B…表示糖浓2%、4%、6%…4.3.3.2琼脂糖凝胶商品名因生产厂家不同而异，最常见的56琼脂糖结构中的重复单位琼脂糖凝胶形成过程琼脂糖结构中的重复单位琼脂糖凝胶形成过程57稳定性化学稳定性稳定pH范围4.5～9.0物理稳定性抗热性：较差，只能在0～45℃使用抗压性：较好，与浓度有关层析性能总工作范围：103～4×107吸附性：需I＞0.02稳定性58Sepharose型号Sepharose2BSepharose4BSepharose6B琼脂糖含量%246颗粒直径m60~20045~16545~165分级范围球状蛋白7×104~4×1076×104~2×1071×104~4×106葡聚糖1×105~2×1073×104~5×1061×104~1×106DNA排阻限bp1353872194pH稳定范围（长程）4~94~94~9pH稳定范围（短程）3~113~113~11最大流速cm/h1011.514Sepharose系列凝胶的类型和部分性质Sepharose型号Sepharose2BSepharo59交联琼脂糖（SepharoseCL）系列凝胶结构强碱条件下用2,3-二溴丙醇或环氧氯丙烷进行交联稳定性化学稳定性：pH3～14，有机溶剂中稳定性提高物理稳定性：抗热、抗压均提高层析性能工作范围：同Sepharose，分为SepharoseCL-2B,4B,6B吸附性：下降交联琼脂糖（SepharoseCL）系列凝胶结构60Sepharose和SepharoseCL类型凝胶的选择性曲线Sepharose和SepharoseCL类型凝胶的选择性61Superose系列凝胶安玛西亚开发的一种具高分辨率，高机械强度，很宽分级范围的新型凝胶过滤介质，是在珠状琼脂糖颗粒的基础上经过两次交联后得到的，适合于组分分子量差异较大的混合物的分离。分为Superose6和Superose12两类，每类又分为普通级和制备级Superose系列凝胶安玛西亚开发的一种具高分辨率，高机械62特点机械和物理稳定性很好，适合于高速分离过程，即使用高粘度的洗脱剂如8mol/L尿素仍能保持较高的流速，在pH7，121℃反复高压灭菌不会对凝胶结构产生明显影响化学稳定性也很好，能够耐受0.2mol/L的NaOH，0.01mol/L的盐酸，1mol/L的醋酸，去污剂如1%SDS，促溶盐类，变性剂如8mol/L尿素和6mol/L盐酸胍等特点63Superose型号Superose6Superose6prepgradeSuperose12Superose12prepgrade琼脂糖含量%661212颗粒直径m11~1520~408~1220~40球状蛋白分级范围5×103~5×1065×103~5×1061×103~3×1051×103~3×105排阻限4×1074×1072×1062×106pH稳定范围（长程）3~123~123~123~12pH稳定范围（短程）1~141~141~141~14Superose系列凝胶的类型和部分性质Superose型号Superose6Superose664SelectivitycurvesofSuperose6and12,globularproteinsSelectivitycurvesofSuperose6and12,dextransSelectivitycurvesofSuperose6and12,DNA-fragmentsSelectivitycurvesofSuperose654.3.3.3聚丙烯酰胺凝胶结构单体：丙烯酰胺CH2=CH-CONH2

交联剂：N,N′-甲叉双丙烯酰胺

CH2=CH-CONH-CH2-NHCO-CH=CH2

型号Bio-GelP-x中，x范围为2～300

其中x=工作范围上限/10004.3.3.3聚丙烯酰胺凝胶结构66聚丙烯酰胺的局部结构示意图聚丙烯酰胺的局部结构示意图67稳定性化学稳定性：稳定pH范围2～11物理稳定性：同Sephadex层析特性总工作范围：100～40万吸附：离子强度I>0.02稳定性68Bio-GelP系列凝胶的类型和部分性质Bio-GelP型号规格水化颗粒直径m得水值ml/g干胶床体积ml/g干胶分级范围流速cm/hBio-GelP-2细45~901.531×102~1.8×1035~10特细<45<10Bio-GelP-4中90~1802.448×102~4×10315~20细45~9010~15特细<45<10Bio-GelP-6中90~1803.76.51×103~6×10315~20细45~9010~15特细<45<10Bio-GelP-10中90~1804.57.51.5×103~2×10415~20细45~9010~15Bio-GelP-30中90~1805.792.5×103~4×1047~13细45~906~11Bio-GelP-60中90~1807.2113×103~6×1044~6细45~903~5Bio-GelP-100中90~1807.5125×103~1×1054~6细45~903~5Bio-GelP系列凝胶的类型和部分性质Bio-Gel693.3.3.4复合结构凝胶（1）交联丙烯基葡聚糖（Sephacryl）结构N,N′-甲叉双丙烯酰胺交联的烯丙基右旋糖苷形成的凝胶，较硬，强度大型号：SephacrylS-200，S-300，S-400，S-500，S-1000型号愈高，孔径愈大，其分子量分离范围可查表3.3.3.4复合结构凝胶（1）交联丙烯基葡聚糖（Seph70HypotheticalpartialstructureofSephacrylHRHypotheticalpartialstructure71稳定性

pH2～11；较Sephadex抗压层析性能工作范围：1000～7亿吸附性：I>0.05稳定性72SephacrylHR型号水化颗粒直径m分级范围pH稳定范围(长程)pH稳定范围(短程)球状蛋白葡聚糖DNA排阻限S-100HR25~751×103~1×105－－3~112~13S-200HR25~755×103~2.5×1051×103~8×1041183~112~13S-300HR25~751×104~1.5×1062×103~4×1051183~112~13S-400HR25~752×104~8×1061×104~2×1062713~112~13S-500HR25~75－4×104~2×10710783~112~13SephacrylHR系列凝胶的类型和部分性质SephacrylHR型号水化颗粒直径m分级范围pH稳定73PressuredropasafunctionofflowrateforSephacrylHR.Pressuredropasafunctionof74SelectivitycurvesforSephacrylHRinphosphatebuffer(0.05M,pH7.0)containingNaCl(0.15M).SelectivitycurvesforSephacr75（2）Superdex系列凝胶是由安玛西亚公司开发的一类新型凝胶过滤介质，是目前分辨率和选择性最高的凝胶介质之一Superdex是将葡聚糖与高度交联的琼脂糖颗粒共价结合而形成的，属于复合型凝胶在该凝胶的结构中，琼脂糖基质决定了凝胶具有高度的理化稳定性，而葡聚糖链决定了凝胶的层析特性（2）Superdex系列凝胶是由安玛西亚公司开发的一类新型76StructureofSuperdex.Dextranchainsarecovalentlylinkedtoahighlycross-linkedagarosematrix.StructureofSuperdex.Dextran77Superdex凝胶颗粒很小，且大小均匀，柱效非常高，即使运行在很高的流速下仍能获得非常高的分辨率；物理稳定性良好，pH7条件下能够承受高压灭菌；pH稳定性良好，清洗时（短程）可以暴露在极端pH（1～14）下而不会对层析行为产生影响；凝胶的分离行为不受去污剂如1%SDS，促溶盐类，变性剂如8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍的影响。该介质同样能在有机溶剂中使用。Superdex凝胶颗粒很小，且大小均匀，柱效非常高，即使运78Superdex型号颗粒直径m分级范围pH稳定范围(长程)pH稳定范围(短程)流速cm/h球状蛋白葡聚糖Superdexpeptide11~151×102~7×103－3~121~14100Superdex30prepgrade24~44<104－3~121~14100Superdex75prepgrade24~443×103~7×1045×102~3×1043~121~14100Superdex7511~153×103~7×1045×102~3×1043~121~14100Superdex200prepgrade24~441×104~6×1051×103~1×1053~121~14100Superdex20011~151×104~6×1051×103~1×1053~121~14100Superdex系列凝胶的类型和部分性质Superdex型号颗粒分级范围pH稳定范围(长程)pH稳定79SelectivitycurvesforSuperdex.SelectivitycurvesforSuperde80（3）UltroGelAcA系列凝胶ReactifsIBF公司开发，为琼脂糖和聚丙烯酰胺混合型凝胶介质，由于聚丙烯酰胺的机械强度优于琼脂糖，因此该系列凝胶介质在机械和理化稳定性上强于普通的琼脂糖凝胶。根据琼脂糖及聚丙烯酰胺的含量不同，UltroGelAcA系列凝胶有几种具有不同分级范围的型号，UltroGelAcA后面两个数字分别表示聚丙烯酰胺和琼脂糖的含量，数字越大，凝胶网孔越小，分级范围越低；数字越小，凝胶网孔越大，分级范围越高。（3）UltroGelAcA系列凝胶ReactifsI81UltroGelAcA221×105～1.2×106UltroGelAcA342×104～3.5×105UltroGelAcA441×104～1.3×105UltroGelAcA545×103～7×104其他类型的凝胶……UltroGelAcA221×105～1.2×106824.3.4凝胶过滤层析实验技术4.3.4.1应用目的分离组别分离：A类与B类、B类与C类、A类与C类分级分离：B类分子间的分离关键在于选择合适的凝胶，好的操作方法分子量测定需先作标准曲线，常用Ve-logM

标准品的选择要考虑分子形状4.3.4凝胶过滤层析实验技术4.3.4.1应用目的834.3.4.2实验设计要点（1）目标高分辨率

Rs应大于1.2（减小W，增大Y）Ve1Ve24.3.4.2实验设计要点（1）目标Ve1Ve284主体分离基线分离主体分离基线分离85回收率高（减少峰宽，可提高回收率）减少稀释（避免以下几种情况）⑴.

涡流扩散（通道不均匀）⑵.

动定相不平衡（速度过快）⑶.

纵向分子扩散（速度过慢）时间短尽可能缩短时间，尤其是活性物质的分离回收率高（减少峰宽，可提高回收率）86（2）凝胶的选择类型⑴.

组别分离

A:C效果最好，其次A:B，尽可能不选B:C⑵.

分级分离已知目的物的MW

原则：选斜率大即Kd差异大，效果好；选排阻极限低的凝胶，可早些洗出。未知目的物的MW先用中等工作范围的，再据结果进行选择。（2）凝胶的选择类型87粒度（颗粒直径）粗中细超细

100～30050～15070～8010～40μmRs∝1/d粒但Rs增加，流速下降粒度（颗粒直径）88层析介质粒径层析介质粒径89（3）样品的准备澄清，不含颗粒状物质（离心或过滤除去不溶物）浓度需综合考虑Vs、样品溶解度、粘度等因素，如Pr浓度＜70mg/ml，一般10～20mg/ml粘度增大对Rs的影响ElutiondiagramsobtainedwhenhemoglobinandNaClwereseparated.Experimentalconditionswereidenticalexceptthattheviscositieswerealteredbytheadditionofincreasingamountsofdextran.（3）样品的准备澄清，不含颗粒状物质（离心或过滤除去不溶物）90I(离子强度)I可用中性盐调节（KCl、NaCl）样品体积Vs主要影响稀释度及Rs…………综合考虑种种因素：分级分离时，Vs一般选1～3%Vt组别分离时，Vs可选30%Vt，最好15～20%I(离子强度)91（4）层析柱的选择Vt据样品量确定分级分离：Vt=30～100Vs

组别分离：Vt=3～6VsH/D

需考虑分辨率RS、稀释度、流速等因素分级分离：H/D可选择在30～100；组别分离：H/D相对可低些。（4）层析柱的选择Vt据样品量确定92材料与结构⑴.

材料玻璃或有机玻璃，耐压抗溶剂且内径一致。⑵.

结构底板不易堵塞且耐压，死体积＜0.1%Vt材料与结构93（5）洗脱剂的选择根据凝胶和溶质的要求来选择洗脱剂应与平衡液一致，以免体积变化；吸附较强的，调节pH和离子强度；需冷冻干燥的，选挥发性盐类；对脱盐操作，有时可选用蒸馏水。（5）洗脱剂的选择根据凝胶和溶质的要求来选择94（6）流速的选择分为线性流速(cm/h)和体积流速(ml/min)流速过大，动定相不平衡；流速过小，纵向扩散增加；凝胶介质有建议流速和最大流速对硬胶SephadexG-10、G-25、G-50

存在关系：v=k·P/L对软胶SephadexG-75～G-200

流速与柱径有关，并在一定操作压下有最大流速，一般可查表（6）流速的选择分为线性流速(cm/h)和体积流速(ml/m954.3.4.3操作要点（1）凝胶的准备凝胶溶胀一般商品湿胶∶洗脱剂（v/v）=3∶1的比例添加洗脱剂，搅匀后即可装柱干胶用量(g)＝πr2h/膨胀度（床体积ml/g干胶）

r和h分别为层析柱的半径和高度，单位均为cm，膨胀度的数据可查凝胶商品参数干胶溶胀方法加蒸馏水室温下进行或沸水浴下进行。4.3.4.3操作要点（1）凝胶的准备96倾析用此法除去上部过细部分（破损凝胶）稠度一般控制沉积体积为总体积70～75%脱气倾析97（2）仪器准备泵检测记录计量柱分部收集器（2）仪器准备泵检测记录计量柱分部收集器98（3）装柱要求：均匀、无裂缝、无气泡、床面平整一般步骤：固定柱→充填→平衡→检验*对于软胶，装柱前须先校对操作压力！（3）装柱要求：均匀、无裂缝、无气泡、床面平整99（4）加样要求：不能干扰凝胶床表面方法：排干法、液面下加样法、加样器法加样量的选择（4）加样要求：不能干扰凝胶床表面100（5）洗脱流速控制

v－△P、H、D、t、粘度、d粒、充填方式收集自动分部收集（可计时也可计滴）检测紫外连续检测，其他检测器（5）洗脱流速控制101（6）清洗和贮藏凝胶柱的清洗一般用洗脱液继续平衡即可，若被脂肪污染，可用0.1～0.5mol/LNaOH（除Sepharose）或非离子表面活性剂清洗。贮藏须加化学试剂防腐，常用抑菌剂包括：0.002%的双氯苯双胍己烷（洗必太），20%乙醇，0.001～0.01%的苯基汞盐，0.02～0.05%的叠氮钠，0.01mol/L的NaOH，0.05%的三氯丁醇等。（6）清洗和贮藏凝胶柱的清洗一般用洗脱液继续平衡即可，若被脂1024.3.5应用举例4.3.5.1脱盐脱盐是指将盐类等小分子物质从样品中除去，从而得到仅剩大分子物质的样品溶液，属组别分离常用介质：SephadexG-10，G-15，G-25……4.3.5应用举例4.3.5.1脱盐103小体积样品大体积样品小体积样品大体积样品1044.3.5.2缓冲液交换通过一定的方法将目标分子从一个溶液体系中置换到另一个所需的缓冲体系中应用于很多层析技术，如离子交换层析、疏水层析、亲和层析之前，使样品溶解于合适的起始缓冲液中属于组别分离，加样量通常很大，包括目标分子在内的大分子都在V0分部被洗脱，洗脱峰一般呈平台4.3.5.2缓冲液交换通过一定的方法将目标分子从一个溶液1054.3.5.3分子量测定凝胶过滤层析是常用的测定生物分子相对分子质量的方法测定分子量的基础是分配系数Kd与溶质分子量的对数logM之间线性关系，也就是介质的选择性曲线的线性部分4.3.5.3分子量测定凝胶过滤层析是常用的测定生物分子相10610KdlogMCBA

工作范围（分级范围）10KdlogMCB107制作Ve-logM标准曲线CalibrationproteinsbeingusedtocalibrateSephadexG-200Superfine.Peaks,1.catalase;2.aldolase;3.bovineserumalbumin;4.ovalbumin;5.chymotrypsinogenA;6.ribonucleaseA:column,K26/70:eluent,0.05Mpotassiumphosphate,pH6.8,containing0.1MNaCland2%sodiumazide.制作Ve-logM标准曲线Calibrationprot108凝胶过滤常用分子量标准分子量标准分子量中文名称英文名称谷胱甘肽（还原型）glutathionin（reduced）300谷胱甘肽（氧化型）glutathionin（oxidized）600促肾上腺皮质激素ACTH3500胰岛素insulin5700细胞色素ccytochromec13000核糖核酸酶AribonucleaseA13700胰凝乳蛋白酶原chymotrypsinogen25000卵清蛋白ovalbumin45000牛血清白蛋白bovinserumalbumin68000醛缩酶aldolase158000过氧化氢酶catalase232000血纤维蛋白原fibrinogen341000铁蛋白ferritin440000蓝葡聚糖-2000bluedextran2000～2000000凝胶过滤常用分子量标准分子量标准分子量中文名称英文名称谷胱109层析分离技术课件110某些情况下，人们采用在有尿素或盐酸胍等变性剂存在的条件下进行凝胶过滤测定分子量，此条件下多肽和蛋白质等变性后转化成自由卷曲构象而减少了结构上差异，对于目标分子和标准分子在结构上存在差异的情况下特别有用。某些情况下，人们采用在有尿素或盐酸胍等变性剂存在的条件下进行111变性条件下用SepharoseCL-6B对几种标准分子层析所得图谱。洗脱峰1：兰葡聚糖，峰2：牛血清白蛋白，峰3：兔免疫球蛋白G的H链，峰4：α-胰凝乳蛋白酶原，峰5：细胞色素c，峰6：胰岛素，峰7：胰岛素B链，峰8：DNP-丙氨酸，层析柱尺寸：1.5×90cm，洗脱剂：含6mol/L盐酸胍的pH8.0，0.1mol/L磷酸钠缓冲液，流速：6.8cm/h变性条件下用SepharoseCL-6B对几种标准分子层析1124.3.5.4混合物的分级分离用凝胶过滤大规模纯化甲型肝炎病毒抗原样品为已通过阴离子交换层析纯化后的甲肝病毒样品比较了Sepharose4FastFlow，Sepharose6FastFlow和SephacrylS-500HR三种介质层析柱尺寸100cm×5cmi.d.洗脱剂为pH7.4，0.01mol/L磷酸盐缓冲液4.3.5.4混合物的分级分离用凝胶过滤大规模纯化甲型肝炎113甲肝病毒在三种不同层析柱中的洗脱曲线，A为Sepharose4FF，B为Sepharose6FF，C为SephacrylS-500HR甲肝病毒在三种不同层析柱中的洗脱曲线，A为Sepharose114三种不同凝胶介质对甲肝病毒纯化效果比较检测项目Sepharose4FFSepharose6FFSephacrylS-500HR上样样品收集样品上样样品收集样品上样样品收集样品体积（ml）503455031250353抗原滴度（EU/ml）256000256002560002560025600020480蛋白浓度（mg/ml）2.50.0572.50.0682.50.054内毒素（EU/ml）201202201VeroDNA（ng/ml）240102403024010抗原回收率%69.062.456.5蛋白去除率%84.383.084.8内毒素去除率%65.537.664.7DNA去除率%71.322.070.6纯化倍数4.43.73.7三种不同凝胶介质对甲肝病毒纯化效果比较检测项目Sephar115从食用真菌Agrocybecylindracea纯化抗真菌肽田头菇素（agrocybin）一种分子量约为9000的抗真菌肽三种层析技术，四步层析操作的串联使用匀浆离心的上清液→DEAE-纤维素阴离子交换层析→Affi-gelblue凝胶亲和层析→MonoS阳离子交换层析→Superdex75HR凝胶过滤层析→SDS显示单一区带从食用真菌Agrocybecylindracea纯化抗真菌116对离子交换层析所得S2分部进行Superdex75HR凝胶过滤层析图谱对DEAE-纤维素未吸附分部进行Affi-gelblue亲和层析图谱对亲和层析所得B2分部进行MonoS离子交换层析图谱对凝胶过滤层析所得F1分部进行SDS所得电泳图对离子交换层析所得S2分部进行Superdex75HR凝1174.3.5.5蛋白质的复性凝胶过滤复性是基于变性蛋白聚集体、不同程度的变性蛋白、复性蛋白及变性剂等因分子大小不同而分离凝胶介质为变性蛋白提供了变性剂“无限稀释”的复性空间，有效分隔了各个蛋白质分子，抑制了分子间因疏水作用而导致的聚集，有助于变性蛋白重新折叠成有活性的蛋白所需的空间构象尿素梯度凝胶过滤层析4.3.5.5蛋白质的复性凝胶过滤复性是基于变性蛋白聚集体1184.4离子交换层析概述相关理论离子交换剂方案设计和层析技术应用实例4.4离子交换层析概述1194.4.1概述4.4.1.1基本原理不同分子在实验条件下带电荷的种类、数量及电荷的分布不同，与离子交换剂在结合强度上有差异，在层析时按结合力由弱到强的顺序被洗脱而得以分离4.4.1概述4.4.1.1基本原理1204.4.1.2离子交换层析的分离过程平衡阶段，离子交换剂与平衡离子结合吸附阶段，混合样品中的分子与离子交换剂结合开始解吸阶段，杂质分子与离子交换剂之间结合较弱而先被洗脱，目标分子仍处于吸附状态完全解吸阶段，目标分子被洗脱再生阶段，用起始缓冲液重新平衡层析柱，以备下次使用4.4.1.2离子交换层析的分离过程平衡阶段，离子交换剂与121离子交换层析过程演示离子交换层析过程演示1224.4.1.3离子交换层析的特点良好的选择性和分辨率蛋白交换容量高，有利于放大分离规模应用灵活，分离原理比较明确，易于对实验过程进行优化操作简单方便有浓缩效应4.4.1.3离子交换层析的特点良好的选择性和分辨率1234.4.2相关理论4.4.2.1蛋白质的电性质蛋白质分子中氨基酸的侧链带有可解离基团，如Asp和Glu的侧链羧基，Tyr的酚羟基，Cys的巯基，Lys的侧链氨基，Arg的胍基，His的咪唑基；修饰基团也会带上电荷蛋白质分子所带电荷的种类和数量并非常数，而是与溶液的pH直接相关

pH在等电点（pI）时蛋白质净电荷为零

pH<pI，带正电荷；pH>pI，带负电荷4.4.2相关理论4.4.2.1蛋白质的电性质124对于一个背景不明的蛋白质，往往先尝试在略偏碱性的条件下采用阴离子交换剂（吸附阴离子）进行层析分离离子交换层析前，了解样品组分的等电点信息对于层析条件的选择当然是很有价值的，而如果能够获得各组分分子电荷随pH变化的情况，将有助于选择分辨率较高的层析条件，而滴定曲线正是给出了蛋白质的净电荷随pH变化的情况对于一个背景不明的蛋白质，往往先尝试在略偏碱性的条件下采用阴125蛋白质等电点常用等电聚焦电泳法测定蛋白质的滴定曲线也通过电泳方法获得，步骤如下：制备一块正方形凝胶，其中含有能够用于生成pH梯度的两性电解质在第一向即x轴方向进行电泳聚焦，就在凝胶中产生了一个稳定的连续的pH梯度（x轴方向）在整个x轴方向加上蛋白样品，并在垂直于第一向的第二向即y轴方向进行电泳蛋白质等电点常用等电聚焦电泳法测定126＋－pH310310310在x轴方向电泳聚焦

在整个x轴方向上加样

阳极

+

阴极

－

蛋白质净电荷＋－阳极

阴极

由于在x轴的不同部位pH不同，蛋白质所带的电荷的种类和数量就不同，表现为电泳过程中迁移的方向和速度上的差异，从而得到迁移率（与蛋白质净电荷数存在正比关系）与pH的关系曲线，这就是蛋白质的滴定曲线pH＋－pH3127蛋白质的滴定曲线

此pH下电荷差异较大+-蛋白质的滴定曲线此pH下电荷差异较大+-128离子交换层析中的异常情况：以蛋白质为例pH＞pI时，吸附于阳IEpH＜pI时，吸附于阴IE某一pH，既可吸附于阳IE，又可吸附于阴IE某一pH，既不吸附于阳IE，又不吸附于阴IE原因：与蛋白质表面电荷的分布等因素有关离子交换层析中的异常情况：以蛋白质为例129蛋白质的层析相关区域蛋白质表面在离子交换时与交换剂发生接触的区域，往往电荷密度较大，决定了层析行为例：眼镜蛇神经毒素六种单乙酰基衍生物碱性蛋白质，由71个氨基酸组成一条多肽链，包含5个Lys侧链氨基和一个游离的N-末端氨基，这六个氨基均能与乙酸酐反应生成乙酰基衍生物，从而能形成六种单乙酰基衍生物，它们有着完全相同的净电荷数，但电荷在蛋白质表面的分布不同蛋白质的层析相关区域130聚异丁烯酸树脂Bio-Rex70（阳离子交换剂）乙酸铵浓度梯度洗脱1未衍生的神经毒素，2-7单乙酰化的神经毒素，8-12多乙酰化的神经毒素聚异丁烯酸树脂Bio-Rex70（阳离子交换剂）1未衍生的131Z值是指蛋白质分子上与离子交换剂发生相互作用的带电位点的数目在进行离子交换层析时，Z值越大，蛋白质与交换剂的结合越牢固；Z值越小，结合越松弛Z值不是蛋白质的特征性常数，与很多因素有关，如：pH、构象、其它离子、结合到吸附剂上的蛋白质数量、离子交换剂的性质Z值是受多种因子综合作用得到的一个平均值，研究表明它与蛋白质的净电荷之间没有直接关系Z值是指蛋白质分子上与离子交换剂发生相互作用的带电位点的数目1324.4.2.2离子交换理论对于蛋白质这样带电荷的生物大分子，与离子交换剂的结合能力取决于：溶液pH，它决定了蛋白质的带电状态蛋白质的层析相关区域，也就是电荷在蛋白质表面的分布情况溶液中离子的种类和离子强度等许多因素4.4.2.2离子交换理论对于蛋白质这样带电荷的生物大分子133pH和离子强度I的影响

pH和离子强度I是控制蛋白质离子交换行为、分辨率、回收率等的重要因素控制pH:离子交换剂有一个工作pH范围，在此范围内能够确保离子交换剂带充足的电荷溶液的pH直接决定了蛋白质带电荷的种类和数量，合适的pH能使目标蛋白既能够很好的结合于交换剂，又能够在温和的条件下被洗脱选择操作pH还须注意目标蛋白的pH稳定范围及陶南效应pH和离子强度I的影响pH和离子强度I是控制蛋白质离134陶南效应离子交换剂表面pH与溶液pH是不一致的。在阳IE表面微环境中，H＋被吸引而OH－被排斥，交换剂表面pH比周围低1个pH单位；而阴IE表面微环境中，OH－被吸引而H＋被排斥，交换剂表面pH比周围高1个pH单位。＋＋＋＋＋＋＋＋－－－H+H+OH-OH-陶南效应离子交换剂表面pH与溶液pH是不一致的。在阳IE表面135

控制I：溶液中的其它离子与蛋白质竞争结合到离子交换剂上，因此离子种类和离子强度是影响蛋白质结合和洗脱的另一重要因素不同离子从交换剂上将蛋白质置换下来的能力是不同的，并且离子类型还对分辨率和不同蛋白质的洗脱顺序会产生影响离子的价态越高，与交换剂结合力越强；价态相同时，原子序数越高，结合力越强控制I：136离子交换动力学

从动力学角度分析，离子交换过程可分为五步：膜扩散：蛋白质在溶液中经扩散作用穿过水膜到达介质颗粒表面，速度取决于水膜两侧蛋白质的浓度差粒子扩散：蛋白质分子进入介质颗粒网孔，并到达发生交换的位置，速度取决于网孔大小（交联度）、离子交换剂功能基团种类、蛋白质分子大小和带电荷数等取代：蛋白质取代交换剂上的反离子而发生离子交换粒子扩散：被置换下来的反离子扩散到达介质颗粒表面，方向与步骤2相反膜扩散：反离子扩散穿过水膜到达溶液，方向与步骤1相反离子交换动力学从动力学角度分析，离子交换过程可分137A＋B＋B＋A＋B＋A＋B＋A＋B＋A＋A＋B＋B＋A＋B＋A＋B＋A＋B＋A＋138

上述五个步骤实际上就是膜扩散、粒子扩散和交换反应三个过程。其中交换反应通常速度比较快，而膜扩散和粒子扩散速度较慢当溶液中蛋白质浓度较低时，膜扩散过程往往最慢而成为整个过程的限速步骤当溶液中蛋白质浓度较高时，粒子扩散过程往往最慢而成为整个过程的限速步骤上述五个步骤实际上就是膜扩散、粒子扩散和交换反应三个1394.4.2.3层析参数分辨率

分离效果用分辨率（RS）来描述。RS定义为两个洗脱峰峰顶对应的洗脱体积（VR或Ve）之差比上两峰在基线上峰宽的和的平均值4.4.2.3层析参数分辨率140层析分离技术课件141

一个纯化系统能够达到的分辨率取决于该系统的选择性、效率和容量

α——选择性

N——柱效率

k′——容量因子一个纯化系统能够达到的分辨率取决于该系统的选择性、效142容量因子k′k′定义为分配平衡时某物质在固定相和流动相中物质的量之比

tR－蛋白质的保留时间

t0－为非滞留组分的保留时间k′的取值与蛋白质在固定相和流动相中的分配性质、层析温度及固定相和流动相的体积比有关，与柱尺寸和流速无关容量因子k′143柱效率用在特定实验条件下层析柱的理论塔板数N或理论塔板高度H来表示，通常表示为每米层析床所包含的理论塔板数H=L/NVR—洗脱峰的洗脱体积

Wh—洗脱峰半峰高（h1/2）时对映的峰宽

L—柱长柱效率与层析介质颗粒大小，实验条件等有关，柱效率下降将导致洗脱峰峰宽变大柱效率144选择性选择性是一个系统分离不同蛋白峰的能力，习惯用相对保留值α来表示

k1’和k2’—洗脱峰1和2的容量因子；

VR1和VR2—洗脱峰1和2的洗脱体积；

V0—非滞留组分的洗脱体积选择性的好坏与离子交换剂上功能基团的性质和数量，pH和离子强度等实验条件有关选择性145选择性和柱效率对分辨率的影响选择性和柱效率对分辨率的影响1464.4.3离子交换剂4.4.3.1离子交换剂的结构和分类离子交换剂由水不溶性基质（支持物）和共价结合在基质上的带电功能基团组成，带电功能基团上还结合有可移动的与功能基团带相反电荷的平衡离子离子交换剂很大程度上决定着分离过程的分辨率，分离的规模和成本4.4.3离子交换剂4.4.3.1离子交换剂的结构和分147分类按基质分类离子交换树脂离子交换纤维素离子交换凝胶按功能基团分类强阳离子交换剂（强酸型）弱阳离子交换剂（弱酸型）强阴离子交换剂（强碱型）弱阴离子交换剂（弱碱型）分类按基质分类148类型名称英文符号功能基团阴离子交换剂强阴三乙基氨乙基TEAE－OCH2CH2N+(C2H5)3季铵基乙基QAE－OCH2CH2N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH3季铵基Q－OCH2N+(CH3)3弱阴二乙基氨乙基DEAE－OCH2CH2N+H(C2H5)2氨乙基AE－OCH2CH2NH3+阳离子交换剂强阳磺丙基SP－OCH2CH2CH2SO3－磺甲基S－OCH2SO3－磷酸基P－OPO3H2弱阳羧甲基CM－OCH2COO－离子交换剂常见功能基团类型名称英文符号功能基团阴离子交换剂强阴三乙基氨乙基TEAE1494.4.3.2离子交换剂的性质粒度（粒径）粒径越小，N值越大，分离效果越好，但是交换容量会变小，层析时背景压力会增大，适用于分析型分离；粒径大，柱效率下降，但是交换容量会提高，背景压力会减小，适合于较大规模的制备分离粒径的均一性对分辨率影响也很大，粒径越均一，分离效果越好4.4.3.2离子交换剂的性质粒度（粒径）150交联度和网孔结构交联度影响着离子交换剂的机械强度、膨胀度、网孔大小、交换容量等电荷密度（取代程度）指基质颗粒单位表面积的取代基数量，它决定着离子交换剂的交换容量、膨胀度等性质膨胀度（吸水值）用每克干胶吸水膨胀后的体积（毫升）表示由基质类型、交联度、功能基团种类和取代程度、溶液pH和离子强度所决定交联度和网孔结构151溶液离子强度对离子交换剂膨胀度的影响

溶液离子强度对离子交换剂膨胀度的影响152溶液pH对离子交换剂膨胀度的影响溶液pH对离子交换剂膨胀度的影响153交换容量指离子交换剂能结合溶液中可交换离子的能力，分为总交换容量和有效交换容量总交换容量又称总离子容量，用每克干介质或每毫升湿胶包含的带电功能基团的数量来表示，其数值取决于离子交换剂的电荷密度总交换容量是离子交换剂的基础参数，对于一种特定的交换剂其数值是恒定的总交换容量并不反映交换剂对蛋白质的实际结合情况交换容量154有效（实际）交换容量指在一定的实验条件下，每克干介质或每毫升湿胶吸附某种蛋白质的实际容量离子交换剂的交联度，蛋白质分子大小，缓冲液pH和I，流速等影响着有效交换容量的大小有效交换容量中又分静态容量和动态容量（层析中流速对有效交换容量的影响较大）交换容量的测定有效（实际）交换容量155其他性质使用的pH范围使用的温度范围耐受的溶剂系统颜色耐压程度气味比重其他性质1564.4.3.3常见的离子交换剂离子交换树脂

树脂是通过化学方法合成的具有特殊网状结构的不溶性高分子化合物，网状结构是在单体聚合时加入一定比例的交联剂来实现的，再通过化学方法往树脂骨架上引入功能基团就得到离子交换树脂缺点：骨架疏水、交联度太大因此蛋白质无法进入网孔、电荷密度太大4.4.3.3常见的离子交换剂离子交换树脂157苯乙烯磺化胺化苯乙烯磺化胺化158离子交换纤维素纤维素分子是由葡萄糖通过β(1→4)糖苷键连接形成的大分子，相邻多糖链之间形成大量氢键，从而形成微晶结构，而微晶区周围又散布着非晶型（无定型）区域离子交换纤维素存在着纤维状和微粒状两种不同的物理形态，前者是将纤维素直接连接功能基团，后者是除去了大部分非晶型区域后再连接功能基团离子交换纤维素159纤维素名称功能基团性质基质类型工作pH范围标称流速（cm/h）蛋白容量（mg/ml）DE51弱碱微粒状2～94030DE52弱碱微粒状2～940120DE53弱碱微粒状2～940120QA52强碱微粒状2～1240140DE92弱碱纤维状2～97540QA92强碱纤维状2～127540SE52强酸微粒状2～1240200SE53强酸微粒状2～1240280CM52弱酸微粒状4.5～1040180SE92强酸纤维状2～1275180CM92弱酸纤维状4.5～1075200P11强弱混合纤维状3～103040Whatman公司的离子交换纤维素纤维素名称功能基团性质基质类型工作pH范围标称流速（cm/h160离子交换纤维素优点：表面积大，开放性的骨架，对大分子物质的交换容量较大DEAE-纤维素和CM-纤维素属于常规生化分离中最常用的介质类型之一其它纤维素离子交换剂：Pharmacia公司生产的DEAE-SephacelBio-Rad公司生产的Cellex系列离子交换纤维素优点：表面积大，开放性的骨架，对大分子物质的交161Pharmacia公司的DEAE-Sephacel将微晶纤维素的微晶区先解体，再重新形成珠状结构，通过环氧氯丙烷交联强化凝胶结构，再连上功能基团特点：填充柱特性好、三度空间大、亲水性强、带电基团分布均匀，体积变化小，层析分辨率高Pharmacia公司的DEAE-Sephacel将微晶纤维162离子交换葡聚糖以SephadexG-25和G-50为基质，连接功能基团形成优点：亲水性，大孔结构，交换容量大，同时具有离子交换作用和分子筛效应种类

DEAE-SephadexA-25DEAE-SephadexA-50QAE-SephadexA-25QAE-SephadexA-50CM-SephadexC-25CM-SephadexC-50SP-SephadexC-25SP-SephadexC-50A代表阴IE，C代表阳IE，25或50代表基质吸水量离子交换葡聚糖163Sephadex的局部结构Sephadex的局部结构164DEAE-SephadexQAE-SephadexCM-SephadexSP-Sepha