DNA测序教学讲解课件

第十三章DNA芯片技术DNAchips第十三章1第一节

概述第一节2一、生物芯片的概念：生物芯片是指通过微电子、微加工技术在平方厘米大小的固体介质表面构建的微型分析系统，以实现对组织细胞中DNA、蛋白质和其他生物成分的快速、高效、敏感的处理与分析。一、生物芯片的概念：3二、生物芯片的类型：生物芯片DNA芯片蛋白质芯片组织芯片细胞芯片其它芯片样品制备芯片核酸扩增芯片毛细管电泳芯片微缩芯片实验室二、生物芯片的类型：生物DNA芯片蛋白质芯片组织芯片细胞芯片4三、DNA芯片的类型：（一）按芯片制备方法分类：DNA芯片原位合成芯片（syntheticgenechip）DNA微阵列芯片（DNAmicroarray）三、DNA芯片的类型：（一）按芯片制备方法分类：DNA芯片5（二）按探针分类：DNA芯片寡核苷酸阵列（芯片）DNA阵列基因芯片cDNA芯片RNA芯片（二）按探针分类：DNA芯片寡核苷酸阵列（芯片）6原位合成芯片与DNA微阵列芯片的比较原位合成芯片DNA微阵列芯片制作方法原位化学合成收集探针、显微打印探针类型寡核苷酸cDNA、基因片段、寡核苷酸、RNA等探针长度短，小于50nt较长，100~500nt或更长最高集成度10~401~10万点阵/cm2万点阵/cm2专利保护专利控制严格无专利控制原位合成芯片与DNA微阵列芯片的比较原位合成芯片7第二节DNA芯片的基本原理与方法第二节8DNA芯片技术流程图芯片制作样品的制备显微光蚀刻压电打印分子打印原位合成芯片探针设计与制备支持物预处理探针打印探针固化DNA微集阵列样品核酸的提取与纯化扩增与标记标记样品的纯化杂交及杂交后清洗扫描与分析一、芯片的制备DNA芯片技术流程图芯片制作样品的制备显微光蚀刻压电打印分子9（一）生物芯片支持物的预处理1、实性材料支持物的预处理硅片、玻璃片、瓷片、聚丙烯酰胺凝胶、聚苯乙烯微珠、磁性微珠等。预处理：表面衍生出羟基、氨基等活性基团。这些基团在合成前用光敏保护基保护起来。氨基硅烷化或包被多聚赖氨酸。（一）生物芯片支持物的预处理1、实性材料支持物的预处理102、膜性材料支持物聚丙烯膜、尼龙膜、硝基纤维素膜、聚偏二氟乙烯膜（PVDF）等。预处理：包被氨基硅烷或多聚赖氨酸。

2、膜性材料支持物聚丙烯膜、尼龙膜、硝基纤维11带负电荷表面+++++++++++++++++++固定于玻璃片上的多聚赖氨酸带负电荷表面++++++12-OH-OH-OH+-O-O-OSi-(CH2)3-NH2C2H3OC2H3OC2H3OSi-(CH2)3-NH2-O-O-OSi-(CH2)3-NH-C-NH-S-NH-C-HS-NH-C-HS1,4-苯二异硫氢酸氨丙基三乙氧基硅烷玻璃片H-C-NH-S-O-O-OSi-(CH2)3-NH-C-NH-S-NH-C-SNH-5`-DNANH-5`-DNA-OH-OH-OH+-O-O-OSi-(CH2)3-NH2C13OSi-(CH2)3-SHSi-(CH2)3-SHOOOSi-(CH2)3-S-S-(CH2)6-O-(PO3)-(T)10-OligomerOOSi-(CH2)3-S-S-(CH2)6-O-(PO3)-(T)10-Oligomer玻璃片N2或真空OSi-(CH2)3-SHSi-(CH2)3-SHOOOSi14（二）原位合成芯片的制作1、显微光蚀刻技术T-XXOXOXOXTXTXOXCXTXTCATXCCATTCCTCCTGGC-XXOXOXOXTXTXOXOXOHOHOXOXOXOXOXO（二）原位合成芯片的制作T-XXXXXXXXXCXCTTTC15DNA测序教学讲解课件16第一轮第二轮第三轮TCGATCGTCTTTTTCCCGGATTCTCGTCGATCGATCGATTTT第第第TCGATCGTC17DNA测序教学讲解课件182、压电打印法2、压电打印法19（三）DNA微集阵列芯片的制作1、探针的制备（1）已克隆的基因片段；（2）PCR、RT-PCR等方法扩增的基因片段；（3）人工合成的DNA片段（寡核苷酸）；（4）细胞中分离的RNA；（5）人工合成的肽核酸。（三）DNA微集阵列芯片的制作1、探针的制备（1）已克隆的基20OHNOHNNNOBOOHNOBNOOBBOOBOOBOPO-OOPO-OOPO-ODNAPNAOHNOHNNNOBOOHNOBNOOBBOOBOOBOPO212、探针的打印1、喷墨打印2、针式打印3、探针的固化DNA测序教学讲解课件22二、样品的制备1、核酸样品的分离纯化2、靶DNA的扩增（PCR）3、样品核酸的标记常用标记：荧光标记物、生物素、放射性同位素。4、标记后样品的纯化二、样品的制备1、核酸样品的分离纯化23三、分子杂交杂交信号的强弱与样品中靶基因的量呈正比。杂交过程中的位阻作用。杂交的条件：盐的浓度杂交的温度杂交时间探针的G+C含量探针所带电荷靶序列的二级结构三、分子杂交24四、检测分析方法：激光扫描仪；激光共聚焦扫描仪。四、检测分析25检测器反光镜激光束荧光束光束分离器物镜支持物向四周发射的荧光发射光滤光镜检测透镜共聚焦针孔共聚焦扫描示意图检测器反光镜激光束荧光束光束分离器物镜支持物向四周发射的荧光26DNA测序教学讲解课件27第三节DNA芯片技术的应用第三节28DNA芯片技术的应用DNA序列测定基因表达分析基因诊断药物研究与开发其它DNA芯片DNA序列测定29

DNA序列测定DNAsequencingDNA序列测定30第一节概述一、DNA序列测定即核酸DNA分子一级结构的测定，是现代分子生物学一项重要的技术。

1963年，Sanger和Thompson等人第一次完成胰岛素51个氨基酸的序列测定，这在当时来说是一件了不起的大事。70年代后期，Sanger和MaxamGilbert等人又建立了核酸序列测定的方法，Sanger双脱氧末端终止法和MaxamGilbert化学裂解法将核酸序列测定技术推进到“直读”阶段，使核酸序列测定变得远比蛋白质氨基酸序列测定容易，这样人们可以通过核酸序列和遗传密码推导出蛋白质氨基酸的序列。第一节概述一、DNA序列测定即31二、DNA序列测定工作原理

在四种反应体系中，寡聚核苷酸分别终止于不同位置的A、T、G或C碱基，将待测DNA片段转变成一系列放射性核素标记的单链DNA片断，并使其一端为一固定的末端，而另一端由于长度不同，成为一系列相差1个碱基的连续末端。经电泳分离，放射自显影，可直接读出DNA的序列。二、DNA序列测定工作原理在四种反应体系中，寡32三、核酸序列分析的目的意义和策略（具体方法）（一）序列分析的目的，2种：1、确证性测序通过测定对突变进行定位和鉴定，应用时测定野生型基因上同源区和突变体的相应序列直接在一张胶片上比较二者序列差异。（已知基因序列）2、从头序列目的是提供一段DNA准确的核苷酸序列。（未知基因序列）三、核酸序列分析的目的意义和策略（具体方法）（一）序列分析的33（二）测定在生物医学领域相应应用，2个方面：1、对已知基因序列检查，特别是有遗传倾向的病例检测相关基因有无突变，有助于阐明疾病发病机理及建立相应诊疗方案。2、对已经克隆的未知序列进行测定，从而阐明该基因的一级结构，如人类基因组计划中大量的工作是要阐明克隆片段的核苷酸的排列顺序。（二）测定在生物医学领域相应应用，2个方面：34四、测序的常用方法1、末端终止法2、化学裂解法3、DNA测序自动化使用特异性引物与单链模板DNA退火，在DNA聚合酶作用下进行延伸反应，用ddNTP终止，用PAGE区分长度仅相差1个核苷酸的ssDNA，从而完成测序的方法。用化学试剂在A、G、C、T处特定的裂解DNA片段，产生一簇各种长度的短链，经过PAGE放射自显影可直读DNA顺序。类似末端终止法，所不同的是用荧光染料标记，计算机自动读出。优点简便、迅速、应用广泛。不需酶促反应，可以对寡核苷酸测序。1、高负荷，1块胶可测16个样品；2、机读不需放射自显影；3、安全不用同位素；4、简单迅速8-10h。四、测序的常用方法1、末端终止法2、化学裂解法3、DNA测序35

不管是上述哪一种方法，测序基本过程如下：1、制备待测DNA序列模板；2、酶促或化学反应将其转变“等差数列”（n=1）；3、PAGE；4、读序。五、测序的基本过程不管是上述哪一种方法，测序基本过程如下：五、测序36一、Sanger双脱氧链终止法原理双脱氧终止法是由Sanger于1977年建立的DNA序列测定方法，也称为引物合成法或酶促合成法。

一、Sanger双脱氧链终止法原理37

反应物：（1）待测DNA模板，可以是单链也可以是双链。（2）DNA聚合酶Ⅰ常用Klenow片段催化特点：①模板为DNA；②原料为dNTP；③存在引物的3`-OH；④遵守碱基配对原则；⑤合成方向5`-3`；⑥校读作用。反应物：（2）DNA聚合酶Ⅰ38（3）原料——dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）。其中一种带32P或35S放射性标记。（4）脱氧核苷酸链延伸的特异性终止剂——2`，3`-双脱氧核苷三磷酸（2`，3`-dideoxynucleosidetripsphate,ddNTP）（3）原料——dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTT39NHHPPPOOOOOOHOHOHHO2`-脱氧核苷三磷酸（dNTP）OOHHHHOCH2A、G、C或TNHHPPPOOOOOOHOHOHHO2`-脱氧核苷三磷酸（40NHHPP32POOOOOOHOHOHHO-32P-dNTPOOHHHHOCH2A、G、C或TNHHPP32POOOOOOHOHOHHO-32P-dN41NHHPPPOO35SOOOHOHOHHO-35S-dNTPOOHHHHOCH2A、G、C或TNHHPPPOO35SOOOHOHOHHO-35S-dNT42NHHPPPOOOOOOHOHOHHO2`，3`-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）OHHHHOCH2A、G、C或TNHHPPPOOOOOOHOHOHHO2`，3`-双脱氧核苷43（5）引物——一段寡核苷酸片段

反应过程：（1）引物的结合引物（其5`-末端带有标记）与模板DNA3`端互补结合；GATCCCTGAGTAGTCACCTAG-OH引物结合部位3`5`5`3`（5）引物——一段寡核苷酸片段反应过程：G44（2）模板链互补链的合成在DNA聚合酶Ⅰ（或Klenow片段）的催化下，按碱基配对原则，逐个将dNTP加到引物的3`-OH端，合成模板链的互补链；3`5`GATCCCTGAGTAGTCACCTAGGGACTCATC-OH5`3`（2）模板链互补链的合成3`5`GATCCCTGAGTAGT45（3）脱氧核苷酸链延伸的终止在实验中设4组反应体系，每一体系中加入4种dNTP混合物和一种ddNTP。反应时，ddNTP和dNTP会竞争掺入新生DNA链中，使DNA链延伸终止，并以ddNTP结尾。由于ddNTP比例较低，所以终止位点是随机的。经过适当的温育之后，将会合成不同长度的DNA片段。（3）脱氧核苷酸链延伸的终止46

在含ddATP的反应管中，DNA片段均以ddATP结尾。同理，含ddGTP、ddCTP或ddTTP的反应管中，DNA片段分别以ddGTP、ddCTP或ddTTP结尾。

在含ddATP的反应管中，DNA片段均以d47CTAGGGACTAGGGACTCACTAGGGACTCATCACTAGGGACTCATCAGTG5`3`3`3`3`5`5`5`dATP、dGTPdCTP、dTTPddATPGATCCCTGAGTAGTCACCTAG-OH3`5`5`3`KlenowCTAGGGACTAGGGACTCACTAGGGACTCAT48（4）合成产物的电泳分离将上述4个反应混合物平行加到同一变性聚丙烯酰胺凝胶的4个相邻的泳道上作电泳分离。分辨率可达1bp。（5）放射性自显影。（6）从胶片上，直接读出单链DNA的核苷酸顺序。（4）合成产物的电泳分离49反应物AGCT模板DNA++++引物++++4种dNTP++++ddNTPddATPddGTPddCTPddTTPKlenow++++Buffer++++反应过程及生成物：

设4组反应体系，组成如下：反应物AG50CTAGGGACTAGGGACTCACTAGGGACTCATCACTAGGGACTCATCAGTG5`3`3`3`3`5`5`5`dATP、dGTPdCTP、dTTPddATPGATCCCTGAGTAGTCACCTAG-OH3`5`5`3`A组KlenowCTAGGGACTAGGGACTCACTAGGGACTCAT51AAACTAGGGA3`CTAGGGACTCA3`CTAGGGACTCATCACTAGGGACTCATCAGTGmarkerAA组的电泳结果AAACTAGGGA3`CTAGGGACTCA3`CTAGG52CTAGGCTAGGGCTAGGGACTCATCAGCTAGGGACTCATCAGTG5`3`3`3`3`5`5`5`dATP、dGTPdCTP、dTTPddGTPGATCCCTGAGTAGTCACCTAG-OH3`5`5`3`G组KlenowCTAGGCTAGGGCTAGGGACTCATCAGCTAG53GGGCTAGG3`CTAGGG3`CTAGGGACTCATCAGCTAGGGACTCATCAGTGmarkerGG组的电泳结果GGGGCTAGG3`CTAGGG3`CTAGGGACTCAT54CTAGGGACCTAGGGACTCCTAGGGACTCATCCTAGGGACTCATCAGTG5`3`3`3`3`5`5`5`dATP、dGTPdCTP、dTTPddCTPGATCCCTGAGTAGTCACCTAG-OH3`5`5`3`C组KlenowCTAGGGACCTAGGGACTCCTAGGGACTCAT55CCCCTAGGGAC3`CTAGGGACTC3`CTAGGGACTCATCCTAGGGACTCATCAGTGmarkerCC组的电泳结果CCCCTAGGGAC3`CTAGGGACTC3`CTAGG56CTAGGGACTCTAGGGACTCATCTAGGGACTCATCAGTCTAGGGACTCATCAGTG5`3`3`3`3`5`5`5`dATP、dGTPdCTP、dTTPddTTPGATCCCTGAGTAGTCACCTAG-OH3`5`5`3`T组KlenowCTAGGGACTCTAGGGACTCATCTAGGGACT57TTTCTAGGGACT3`CTAGGGACTCAT3`CTAGGGACTCATCAGTCTAGGGACTCATCAGTGmarkerTT组的电泳结果TTTCTAGGGACT3`CTAGGGACTCAT3`CT58TTTCCCGGGGAAA45678910111214151617markerTAGC电泳方向TTTCCCGGGGAAA4567891011121415159GATCCCTGAGTAGTCAC3`5`5`3`CTAGGGACTCATCAGTGGATCCCTGAGTAGTCAC3`5`5`3`CTAGG60DNA测序教学讲解课件61二、DNA序列测定的策略（一）末端终止法常用试剂1、载体（1）M13噬菌体载体。用于单链模板的克隆和测序（2）pUC质粒载体。用于双链模板的克隆和测序。2、通用引物（一般含15~30bp）二、DNA序列测定的策略62通用引物

载体DNA互补序列

待测DNA合成新链

载体DNA互补序列

通用引物

合成新链

通用载体DNA待测合成载体DNA通用合成634、放射性标记目前常用的是[35S]-dATP5、DNA聚合酶（1）Klenow片段（2）测序酶（sequenase)目前用的是测序酶2.0版（3）TaqDNA聚合酶4、放射性标记64二、大片段DNA序列测定的策略1、随机法（或称鸟枪法）大片段DNA超声波、核酸酶限制酶DNA测序二、大片段DNA序列测定的策略大片段DNA超声波、核酸酶DN6512345

12

23

234

345

片段序列重叠排列1234512266DNA测序教学讲解课件672、嵌套缺失法（或互套缺失法）插入片段+载体5`凸出端3`凸出端（1）限制酶切割两种限制酶酶切位点2、嵌套缺失法（或互套缺失法）插入片段5`凸出端3`凸出端（68（2）外切核酸酶Ⅲ切割外切核酸酶Ⅲ核酸酶SⅠ（2）外切核酸酶Ⅲ切割外切核酸酶Ⅲ核酸酶SⅠ69（3）克隆T4DNA连接酶（3）克隆T4DNA连接酶70（4）测序（4）测序713、引物延伸法4、限制性片段亚克隆法3、引物延伸法72DNA的自动测序采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳，应用四色荧光染料标记的ddNTP(标记终止物法)，因此通过单引物PCR测序反应，生成的PCR产物则是相差1个碱基的3'末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物，使得四种荧光染料的测序PCR产物可在一根毛细管内电泳，从而避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高了测序的精确度。DNA的自动测序采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电73DNA测序教学讲解课件74由于分子大小不同，在毛细管电泳中的迁移率也不同，当其通过毛细管读数窗口段时，激光检测器窗口中的CCD检测器就可对荧光分子逐个进行检测，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在CCD上同步成像，分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列，从而达到DNA测序的目的。分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。由于分子大小不同，在毛细管电泳中的迁移率也不同，当其通过毛细75使用4种荧光素标记的双脱氧核苷酸，毛细管电泳和激光扫描技术使测序自动化，一个泳道一次可测大约1000个核苷酸。测序已成为可以快速完成的常规技术，人类基因组测序已经完成，多态性的研究和功能基因组学已经成为研究的热点。使用4种荧光素标记的双脱氧核苷酸，毛细管电泳和激光扫描技术使76DNA测序教学讲解课件77DNA测序教学讲解课件78谢谢！谢谢！79第十三章DNA芯片技术DNAchips第十三章80第一节

概述第一节81一、生物芯片的概念：生物芯片是指通过微电子、微加工技术在平方厘米大小的固体介质表面构建的微型分析系统，以实现对组织细胞中DNA、蛋白质和其他生物成分的快速、高效、敏感的处理与分析。一、生物芯片的概念：82二、生物芯片的类型：生物芯片DNA芯片蛋白质芯片组织芯片细胞芯片其它芯片样品制备芯片核酸扩增芯片毛细管电泳芯片微缩芯片实验室二、生物芯片的类型：生物DNA芯片蛋白质芯片组织芯片细胞芯片83三、DNA芯片的类型：（一）按芯片制备方法分类：DNA芯片原位合成芯片（syntheticgenechip）DNA微阵列芯片（DNAmicroarray）三、DNA芯片的类型：（一）按芯片制备方法分类：DNA芯片84（二）按探针分类：DNA芯片寡核苷酸阵列（芯片）DNA阵列基因芯片cDNA芯片RNA芯片（二）按探针分类：DNA芯片寡核苷酸阵列（芯片）85原位合成芯片与DNA微阵列芯片的比较原位合成芯片DNA微阵列芯片制作方法原位化学合成收集探针、显微打印探针类型寡核苷酸cDNA、基因片段、寡核苷酸、RNA等探针长度短，小于50nt较长，100~500nt或更长最高集成度10~401~10万点阵/cm2万点阵/cm2专利保护专利控制严格无专利控制原位合成芯片与DNA微阵列芯片的比较原位合成芯片86第二节DNA芯片的基本原理与方法第二节87DNA芯片技术流程图芯片制作样品的制备显微光蚀刻压电打印分子打印原位合成芯片探针设计与制备支持物预处理探针打印探针固化DNA微集阵列样品核酸的提取与纯化扩增与标记标记样品的纯化杂交及杂交后清洗扫描与分析一、芯片的制备DNA芯片技术流程图芯片制作样品的制备显微光蚀刻压电打印分子88（一）生物芯片支持物的预处理1、实性材料支持物的预处理硅片、玻璃片、瓷片、聚丙烯酰胺凝胶、聚苯乙烯微珠、磁性微珠等。预处理：表面衍生出羟基、氨基等活性基团。这些基团在合成前用光敏保护基保护起来。氨基硅烷化或包被多聚赖氨酸。（一）生物芯片支持物的预处理1、实性材料支持物的预处理892、膜性材料支持物聚丙烯膜、尼龙膜、硝基纤维素膜、聚偏二氟乙烯膜（PVDF）等。预处理：包被氨基硅烷或多聚赖氨酸。

2、膜性材料支持物聚丙烯膜、尼龙膜、硝基纤维90带负电荷表面+++++++++++++++++++固定于玻璃片上的多聚赖氨酸带负电荷表面++++++91-OH-OH-OH+-O-O-OSi-(CH2)3-NH2C2H3OC2H3OC2H3OSi-(CH2)3-NH2-O-O-OSi-(CH2)3-NH-C-NH-S-NH-C-HS-NH-C-HS1,4-苯二异硫氢酸氨丙基三乙氧基硅烷玻璃片H-C-NH-S-O-O-OSi-(CH2)3-NH-C-NH-S-NH-C-SNH-5`-DNANH-5`-DNA-OH-OH-OH+-O-O-OSi-(CH2)3-NH2C92OSi-(CH2)3-SHSi-(CH2)3-SHOOOSi-(CH2)3-S-S-(CH2)6-O-(PO3)-(T)10-OligomerOOSi-(CH2)3-S-S-(CH2)6-O-(PO3)-(T)10-Oligomer玻璃片N2或真空OSi-(CH2)3-SHSi-(CH2)3-SHOOOSi93（二）原位合成芯片的制作1、显微光蚀刻技术T-XXOXOXOXTXTXOXCXTXTCATXCCATTCCTCCTGGC-XXOXOXOXTXTXOXOXOHOHOXOXOXOXOXO（二）原位合成芯片的制作T-XXXXXXXXXCXCTTTC94DNA测序教学讲解课件95第一轮第二轮第三轮TCGATCGTCTTTTTCCCGGATTCTCGTCGATCGATCGATTTT第第第TCGATCGTC96DNA测序教学讲解课件972、压电打印法2、压电打印法98（三）DNA微集阵列芯片的制作1、探针的制备（1）已克隆的基因片段；（2）PCR、RT-PCR等方法扩增的基因片段；（3）人工合成的DNA片段（寡核苷酸）；（4）细胞中分离的RNA；（5）人工合成的肽核酸。（三）DNA微集阵列芯片的制作1、探针的制备（1）已克隆的基99OHNOHNNNOBOOHNOBNOOBBOOBOOBOPO-OOPO-OOPO-ODNAPNAOHNOHNNNOBOOHNOBNOOBBOOBOOBOPO1002、探针的打印1、喷墨打印2、针式打印3、探针的固化DNA测序教学讲解课件101二、样品的制备1、核酸样品的分离纯化2、靶DNA的扩增（PCR）3、样品核酸的标记常用标记：荧光标记物、生物素、放射性同位素。4、标记后样品的纯化二、样品的制备1、核酸样品的分离纯化102三、分子杂交杂交信号的强弱与样品中靶基因的量呈正比。杂交过程中的位阻作用。杂交的条件：盐的浓度杂交的温度杂交时间探针的G+C含量探针所带电荷靶序列的二级结构三、分子杂交103四、检测分析方法：激光扫描仪；激光共聚焦扫描仪。四、检测分析104检测器反光镜激光束荧光束光束分离器物镜支持物向四周发射的荧光发射光滤光镜检测透镜共聚焦针孔共聚焦扫描示意图检测器反光镜激光束荧光束光束分离器物镜支持物向四周发射的荧光105DNA测序教学讲解课件106第三节DNA芯片技术的应用第三节107DNA芯片技术的应用DNA序列测定基因表达分析基因诊断药物研究与开发其它DNA芯片DNA序列测定108

DNA序列测定DNAsequencingDNA序列测定109第一节概述一、DNA序列测定即核酸DNA分子一级结构的测定，是现代分子生物学一项重要的技术。

1963年，Sanger和Thompson等人第一次完成胰岛素51个氨基酸的序列测定，这在当时来说是一件了不起的大事。70年代后期，Sanger和MaxamGilbert等人又建立了核酸序列测定的方法，Sanger双脱氧末端终止法和MaxamGilbert化学裂解法将核酸序列测定技术推进到“直读”阶段，使核酸序列测定变得远比蛋白质氨基酸序列测定容易，这样人们可以通过核酸序列和遗传密码推导出蛋白质氨基酸的序列。第一节概述一、DNA序列测定即110二、DNA序列测定工作原理

在四种反应体系中，寡聚核苷酸分别终止于不同位置的A、T、G或C碱基，将待测DNA片段转变成一系列放射性核素标记的单链DNA片断，并使其一端为一固定的末端，而另一端由于长度不同，成为一系列相差1个碱基的连续末端。经电泳分离，放射自显影，可直接读出DNA的序列。二、DNA序列测定工作原理在四种反应体系中，寡111三、核酸序列分析的目的意义和策略（具体方法）（一）序列分析的目的，2种：1、确证性测序通过测定对突变进行定位和鉴定，应用时测定野生型基因上同源区和突变体的相应序列直接在一张胶片上比较二者序列差异。（已知基因序列）2、从头序列目的是提供一段DNA准确的核苷酸序列。（未知基因序列）三、核酸序列分析的目的意义和策略（具体方法）（一）序列分析的112（二）测定在生物医学领域相应应用，2个方面：1、对已知基因序列检查，特别是有遗传倾向的病例检测相关基因有无突变，有助于阐明疾病发病机理及建立相应诊疗方案。2、对已经克隆的未知序列进行测定，从而阐明该基因的一级结构，如人类基因组计划中大量的工作是要阐明克隆片段的核苷酸的排列顺序。（二）测定在生物医学领域相应应用，2个方面：113四、测序的常用方法1、末端终止法2、化学裂解法3、DNA测序自动化使用特异性引物与单链模板DNA退火，在DNA聚合酶作用下进行延伸反应，用ddNTP终止，用PAGE区分长度仅相差1个核苷酸的ssDNA，从而完成测序的方法。用化学试剂在A、G、C、T处特定的裂解DNA片段，产生一簇各种长度的短链，经过PAGE放射自显影可直读DNA顺序。类似末端终止法，所不同的是用荧光染料标记，计算机自动读出。优点简便、迅速、应用广泛。不需酶促反应，可以对寡核苷酸测序。1、高负荷，1块胶可测16个样品；2、机读不需放射自显影；3、安全不用同位素；4、简单迅速8-10h。四、测序的常用方法1、末端终止法2、化学裂解法3、DNA测序114

不管是上述哪一种方法，测序基本过程如下：1、制备待测DNA序列模板；2、酶促或化学反应将其转变“等差数列”（n=1）；3、PAGE；4、读序。五、测序的基本过程不管是上述哪一种方法，测序基本过程如下：五、测序115一、Sanger双脱氧链终止法原理双脱氧终止法是由Sanger于1977年建立的DNA序列测定方法，也称为引物合成法或酶促合成法。

一、Sanger双脱氧链终止法原理116

反应物：（1）待测DNA模板，可以是单链也可以是双链。（2）DNA聚合酶Ⅰ常用Klenow片段催化特点：①模板为DNA；②原料为dNTP；③存在引物的3`-OH；④遵守碱基配对原则；⑤合成方向5`-3`；⑥校读作用。反应物：（2）DNA聚合酶Ⅰ117（3）原料——dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）。其中一种带32P或35S放射性标记。（4）脱氧核苷酸链延伸的特异性终止剂——2`，3`-双脱氧核苷三磷酸（2`，3`-dideoxynucleosidetripsphate,ddNTP）（3）原料——dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTT118NHHPPPOOOOOOHOHOHHO2`-脱氧核苷三磷酸（dNTP）OOHHHHOCH2A、G、C或TNHHPPPOOOOOOHOHOHHO2`-脱氧核苷三磷酸（119NHHPP32POOOOOOHOHOHHO-32P-dNTPOOHHHHOCH2A、G、C或TNHHPP32POOOOOOHOHOHHO-32P-dN120NHHPPPOO35SOOOHOHOHHO-35S-dNTPOOHHHHOCH2A、G、C或TNHHPPPOO35SOOOHOHOHHO-35S-dNT121NHHPPPOOOOOOHOHOHHO2`，3`-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）OHHHHOCH2A、G、C或TNHHPPPOOOOOOHOHOHHO2`，3`-双脱氧核苷122（5）引物——一段寡核苷酸片段

反应过程：（1）引物的结合引物（其5`-末端带有标记）与模板DNA3`端互补结合；GATCCCTGAGTAGTCACCTAG-OH引物结合部位3`5`5`3`（5）引物——一段寡核苷酸片段反应过程：G123（2）模板链互补链的合成在DNA聚合酶Ⅰ（或Klenow片段）的催化下，按碱基配对原则，逐个将dNTP加到引物的3`-OH端，合成模板链的互补链；3`5`GATCCCTGAGTAGTCACCTAGGGACTCATC-OH5`3`（2）模板链互补链的合成3`5`GATCCCTGAGTAGT124（3）脱氧核苷酸链延伸的终止在实验中设4组反应体系，每一体系中加入4种dNTP混合物和一种ddNTP。反应时，ddNTP和dNTP会竞争掺入新生DNA链中，使DNA链延伸终止，并以ddNTP结尾。由于ddNTP比例较低，所以终止位点是随机的。经过适当的温育之后，将会合成不同长度的DNA片段。（3）脱氧核苷酸链延伸的终止125

在含ddATP的反应管中，DNA片段均以ddATP结尾。同理，含ddGTP、ddCTP或ddTTP的反应管中，DNA片段分别以ddGTP、ddCTP或ddTTP结尾。

在含ddATP的反应管中，DNA片段均以d126CTAGGGACTAGGGACTCACTAGGGACTCATCACTAGGGACTCATCAGTG5`3`3`3`3`5`5`5`dATP、dGTPdCTP、dTTPddATPGATCCCTGAGTAGTCACCTAG-OH3`5`5`3`KlenowCTAGGGACTAGGGACTCACTAGGGACTCAT127（4）合成产物的电泳分离将上述4个反应混合物平行加到同一变性聚丙烯酰胺凝胶的4个相邻的泳道上作电泳分离。分辨率可达1bp。（5）放射性自显影。（6）从胶片上，直接读出单链DNA的核苷酸顺序。（4）合成产物的电泳分离128反应物AGCT模板DNA++++引物++++4种dNTP++++ddNTPddATPddGTPddCTPddTTPKlenow++++Buffer++++反应过程及生成物：

设4组反应体系，组成如下：反应物AG129CTAGGGACTAGGGACTCACTAGGGACTCATCACTAGGGACTCATCAGTG5`3`3`3`3`5`5`5`dATP、dGTPdCTP、dTTPddATPGATCCCTGAGTAGTCACCTAG-OH3`5`5`3`A组KlenowCTAGGGACTAGGGACTCACTAGGGACTCAT130AAACTAGGGA3`CTAGGGACTCA3`CTAGGGACTCATCACTAGGGACTCATCAGTGmarkerAA组的电泳结果AAACTAGGGA3`CTAGGGACTCA3`CTAGG131CTAGGCTAGGGCTAGGGACTCATCAGCTAGGGACTCATCAGTG5`3`3`3`3`5`5`5`dATP、dGTPdCTP、dTTPddGTPGATCCCTGAGTAGTCACCTAG-OH3`5`5`3`G组KlenowCTAGGCTAGGGCTAGGGACTCATCAGCTAG132GGGCTAGG3`CTAGGG3`CTAGGGACTCATCAGCTAGGGACTCATCAGTGmarkerGG组的电泳结果GGGGCTAGG3`CTAGGG3`CTAGGGACTCAT133CTAGGGACCTAGGGACTCCTAGGGACTCATCCTAGGGACTCATCAGTG5`3`3`3`3`5`5`5`dATP、dGTPdCTP、dTTPddCTPGATCCCTGAGTAGTCACCTAG-OH3`5`5`3`C组KlenowCTAGGGACCTAGGGACTCCTAGGGACTCAT134CCCCTAGGGAC3`CTAGGGACTC3`CTAGGG