分子生物学：第十一章 疾病产生的分子基础

1

第十一章疾病产生的分子基础Chapter11MolecularBasisofDiseasesDevelopment

2人类疾病如白血病、恶性肿瘤、糖尿病、神经退行性疾病、心脑血管、高血压等发生和发展都涉及到有关蛋白质及其复合物的结构、功能和相互作用异常。疾病的本质是蛋白质功能紊乱，基本原理是各种原因引起蛋白质质和量的改变。3

1.基因结构的改变；2.受细胞调节因素或其它因素影响使基因的表达发生改变；3.外来的致病基因；4.蛋白质翻译后加工及蛋白质降解发生变化。蛋白质功能紊乱的原因各不相同，具有不同分子机制。4第一节基因结构改变与疾病

第二节细胞间信号异常与疾病第三节

细胞内因素与疾病第四节

翻译后加工运输障碍与疾病第五节

蛋白质降解异常与疾病第六节病原微生物基因引起的疾病第七节

疾病分子机制的研究策略5第一节基因结构改变与疾病一、基因突变二、基因突变的遗传学效应三、结构基因变异导致的疾病四、调控序列变异导致基因表达水平变化6一、基因突变的多种类型点突变是单个碱基的替换缺失是一个或多个核苷酸的丢失插入是一个或多个核苷酸的增加倒位是一段核苷酸序列染色体位置的改变基因突变还分为配子突变与体细胞突变动态突变指串联重复拷贝数随世代的传递而改变7例脆性X综合征

“CCG”重复发生在FMR1（脆性X智力低下基因1）的5´非翻译区，拷贝数不稳定。8~50拷贝(正常人)52~200拷贝(携带者)200~1000拷贝(患者)8强直性肌营养不良

DMPK基因3´非翻译区CTG三核苷酸序列异常重复扩增超过100（正常人为5～

40），重复数目与症状严重性相关；Huntington舞蹈病huntington基因内的CAG三核苷酸序列异常重复扩增，亨廷顿病患者35～100个或更多（正常人为11～30）；Friedreich共济失调症内含子CAA拷贝数过度增加。91.碱基置换突变(substitutionmutation)二、不同的基因突变引起不同的遗传效应a.错义突变(missensemutation)b.无义突变(nonsensemutation)c.同义突变(consensemutation)10a.错义突变（missensemutation）指DNA改变后mRNA中相应密码子发生改变，编码另一种氨基酸，使蛋白质中的氨基酸发生改变。

有些错义突变不影响蛋白质或酶的生物活性，不表现出明显的表型效应。11b.无义突变(nonsensemutation)亮氨酸的密码子UUA，中间的U变为A这样一个碱基变化就会成为（终止密码子）UAA。酪氨酸的密码子是UAC，置换突变使UAC变为密码子UAG后翻译便终止。UAG、UGA、UAA终止密码子12c.同义突变(synonymousmutation)：密码子发生改变,但所编码的氨基酸不变。例如：CUU

CUC

CUG→亮氨酸13

2.缺失或插入突变(deletionorinsertionmutation)a.密码子缺失或插入b.移码突变(frame-shiftmutation)c.整基因或大片段缺失

14a.密码子缺失或插入CTGACTCCTGAGGAGAAGTCTLeuThrProGluGluLysSerCTGACTGAGGAGAAGTCTLeuThrGluGluLysSerCTGACTCCGGAGAAGTCT

LeuThrProGluLysSerCCTCCTGAGGAGAAGTCT

ProProGluGluLysSer15b.移码突变CTGACTCCTGAGGAGAAGTCTLeuThrProGluGluLysSer

TGACTCCTGAGGAGAAGTCT

TGACTCCTGAGGAGAAGTCTCTACTCCTGAGGAGAAGTCTCTACTCCTGAGGAGAAGTCT

LeuLeuLeuArgArgSer

插入或缺失带来的无义突变CTGACTCCTGAGGAGAAGTCTLeuThrProGluGluLysSer163.融合突变(fusionmutation)

细胞减数分裂时同源染色体不等交换而致基因间错位配对,产生两种含不同等位基因的染色体。171819白血病中部分常见的融合基因204.基因突变影响hnRNA的剪接

基因突变发生在hnRNA的一级结构上特定的剪接位点上，形成新的剪接位点或使正常剪接位点消失，导致hnRNA的剪接错误，产生异常的mRNA，最终产生异常的蛋白表达产物，改变生物性状。21真核生物基因的剪接位点：由内含子的5′端“GT”和3′端“AG”，及内含子和外显子内的其它调控元件共同决定。EXON1INTRON1EXON2EXON1EXON2EXON1INTRON1EXON2hnRNASplicing?YesNo22例：家族性孤立性生长激素缺乏Ⅱ型遗传病由于GH-1基因的EXONⅢ上第5nt由G→A，破坏一个ESE，使EXONⅢ被跳过，而最终造成编码蛋白缩短，影响功能。23转入了人缺陷型的GH-1基因利用RNAi使导入基因沉默2007年2425三

结构基因改变导致蛋白质变化引起疾病结构基因发生改变会改变蛋白质的一级结构，进而改变蛋白质的理化性质。26

1.蛋白质结构变化引起的疾病（1）血红蛋白病(hemoglobinopathy)27血红蛋白结构血红蛋白是由4条肽链（两个α和两个β链）组成的。每条肽链都类似于肌红蛋白的肽链，都结合一个血红素。28血红蛋白病——镰刀形细胞贫血症2930基因突变类型异常Hb氨基酸变化临床特征错义突变HbShuangfengα27Glu→Lys(GAG→AAG)不稳定Hb病HbSβ6Glu→Val(GAG→GUG)镰刀型细胞贫血HbBibbaα136Leu→Pro(CUG→CCA)不稳定Hb病无义突变HbMckeesRocksβ145Tyr→终止(UAU→UAA)不稳定Hb病终止密码突变HbConstantSpringα142UAA→CAA(延长：142Gln---173)α-地贫血红蛋白病分子基础31基因突变类型异常Hb氨基酸变化临床特征密码子缺失HbGunHillβ91～95缺失不稳定Hb病密码子插入HbGradyα118与119间插入3个氨基酸无明显症状移码突变HbTakβ147UAA→ACUAA延长：Thr---158UAA不稳定Hb病融合突变HbLepore-Bostonδ87(Gln)-β116(His)β-地贫HbKenyaγ81(Leu)-β86(Ala)β-地贫血红蛋白病分子基础32（2）家族性高胆固醇血症

一种常染色体显性遗传疾病，其特征为低密度脂蛋白（LDL）-胆固醇水平明显升高，可出现黄色瘤和动脉硬化症。

病因：肝脏表面特异性的LDL-受体数目减少或缺乏，导致肝脏对血循环中LDL-胆固醇的清除能力下降，进而引起血循环中LDL-胆固醇水平升高。33LDL受体基因变异，导致其编码蛋白结构异常，功能下降或完全丧失。配体结合结构域，由LDL受体蛋白N端292个氨基酸残基组成，富含半胱氨酸。该结构中有7个由40个氨基酸残基组成的重复序列(天冬-半胱-X-天冬-甘-丝-天冬-谷)，每个重复序列中含有6个半胱氨酸残基，全部42个半胱氨酸。341.配体结合结构域2.EGF前体结构域3.含糖基结构域4.跨膜结构域5.胞液结构域LDL受体ABNH2Cys1234567CCOOH352.蛋白质合成量变化引起的疾病36人珠蛋白基因簇及珠蛋白基因结构37

珠蛋白基因的表达在时空上受到遗传因素的精确调控，表现为以下特点：组织特异性发育阶段特异性协同性38α-地贫基因缺失类型α1α2正常基本正常αααα+轻度贫血α+α+轻度贫血αα0高度贫血α+α0HbBart’s综合征α0α039β珠蛋白结构基因突变抑制β珠蛋白合成使β珠蛋白量减少甚至完全缺失,引起β-地贫第17位赖氨酸密码子AAG(Lys)→TAG,发生无义突变,引起β0地贫;β珠蛋白基因的编码顺序内插入或缺失1、２、４或７个核苷酸，会使突变点以后的读码框遭到破坏，往往造成β-珠蛋白肽链合成提前终止，而引起β0地贫。40四、调控序列变异导致基因表达水平变化顺式作用元件的基因突变，会降低β珠蛋白基因的转录，使β珠蛋白合成减少，引起β+-地贫。TATA盒：-32（C→A)、-30(T→C)、-29(A→G)、-28(A→G)。CAAT盒：-101、-92、-88、-87、-86等位点的点突变。CAATTATACAPPolyA尾130311041051465′3′IVSⅠIVSⅡIS41启动子和外显子1之间大于10kb的缺失;另一种是启动子和外显子1之间大于6kb的缺失。两种突变都使LDL受体基因的表达能力完全丧失。LDL受体启动子变异42一些内含子的变异也会影响蛋白质的合成，使体内相应蛋白质含量减少或缺失。ApoB100基因内含子的第一个碱基会发生G→T突变，突变基因转录后生产的hnRNA，会影响ApoB100mRNA的正常剪切。43第二节细胞间信号异常导致基因

表达异常引起疾病

人体各细胞间通过激素、神经递质、旁分泌信号等保持细胞间的联系，调节彼此的代谢。基因表达也受到细胞间信号的调控。44AFP接受异常细胞增殖信号成为肝癌发生的重要因素胚胎发育过程中,AFP增强子激活,而沉寂子处于抑制状态。胎儿出生后,AFP沉寂子处于活化状态,阻碍增强子的启动效应。在异常细胞增殖信号的作用下,c-myc、c-fos、c-jun等癌基因表达异常增加,其表达产物与AFP基因顺式作用元件结合,激活AFP基因表达。45粉尘刺激→肺支气管上皮、肺泡巨噬细胞→分泌TGF-β1→成纤维细胞→促细胞分裂和ECM蛋白基因表达→ECM增加→矽肺发生尘肺是由于长期吸入大量含游离二氧化硅粉尘引起的以肺纤维化为主要病变的疾病46第三节细胞内因素导致基因

表达异常引起疾病异常的细胞内信号持续高血糖引起的糖尿病心肌病高血糖→内皮细胞二酰甘油(DAG)↑→⊕PKC→⊕（血管紧张素转换酶）ACE→AngⅡ↑→心肌重塑、心肌肥大。47异常的DNA甲基化（不同的DNA甲基化模式形成不同的表观遗传特征）hCG5´转录起始区低甲基化→非滋养层细胞hCG↑→受体结合→⊕cAMP→Tumor↑48ProteinscomplexedwithDNAallowformore“open”structure;canbetranscribed….Methylationleadstochangeinchromatinstructure;morecondensedstateistranscriptionallyinactive…genesare“off”

…49第四节

翻译后加工运输障碍与疾病50

白化Albinism

51酪氨酸酶与Ⅰ型泛素性白化病酪氨酸酶催化结构域点突变可以使酪氨酸酶的活性降低甚至消失,黑色素合成减少或不能合成,导致Ⅰ型泛素性白化病;酪氨酸酶催化结构域以外的点突变也能导致色素缺失,蛋白质不能正确折叠.没有正常折叠的酪氨酸酶不能从内质网输出而滞留在内质网,无法完成其成熟及运输过程。52蛋白转运异常酪氨酸酶P蛋白高尔基体黑色素体P蛋白基因突变黑色素合成障碍引起Ⅱ型泛发性白化病内质网酪氨酸酶与Ⅰ型泛素性白化病53第五节

蛋白质降解异常与疾病54蛋白质降解途径

溶酶体途径，降解细胞吞入的胞外蛋白质泛素-蛋白酶体途径，降解胞内泛素化的蛋白质泛素(ubiquitin,Ub)E1(特异性泛素激活酶)E2(泛素结合酶),E3(泛素连接酶)

蛋白酶体(proteasome)

蛋白的降解5556泛素-蛋白酶体系统活性被异常抑制或激活均可导致机体紊乱。2004年诺贝尔化学奖阿龙·切哈诺沃(Aaron

Ciechanover)阿夫拉姆·赫什科(Avram

Hershko)欧文·罗斯(Irwin

Rose)57高血脂:载脂蛋白的过度降解泛素-蛋白酶体系统在维持正常载脂蛋白含量中起到重要的作用，该系统功能障碍，会导致载脂蛋白含量异常。ApoAⅠ,ApoB100,ApoE,etc.58阿尔茨海默病:蛋白酶体活性的抑制

阿尔茨海默病（Alzheimer’sdisease,AD）是一种中枢神经系统退行性病变的疾病。临床上首先表现为近期记忆力降低,继而表现持续性智能衰退、失语、判断推理能力丧失,以及运动障碍等。AD最显著的神经病理组织学特征是老年斑和神经原纤维缠结。现已发现,β-淀粉样蛋白在老年斑的形成过程中起十分重要的作用。59第六节病原微生物基因引起的疾病感染引起机械或生物学损伤；争夺营养造成营养缺乏；毒素引起细胞代谢功能异常；基因整合到宿主基因组，造成基因结构改变和表达异常。60第七节基因结构和表达与疾病的研究策略1.通过基因结构分析确定基因变异核糖核酸酶切分析、杂合双链分析、化学切割错配、酶促切割错配3.通过功能学研究确定致病基因转基因技术、基因敲除、反义技术、基因诱导超表达2.基因表达水平分析差异显示、抑制消减杂交、基因表达系列分析61

基本原理:在一定条件下，异源双链核酸分子RNA：RNA或RNA：DNA中错配碱基可被核糖核酸酶RNase识别并切割，通过凝胶电泳分析酶切片段的大小，即可确定错配的位置。一、基因结构分析1.核糖核酸酶切分析（RNasecleavage）62GCATACGTAT野生型5´3´3´5´突变型GCTTACGAAT3´3´5´5´异源杂合双链酶切GCAUACGTAT3´5´3´5´3´5´3´5´GCAUACGAAT？体外合成RNA探针GCAUA5´3´野生型探针163GCATACGTAT野生型5´3´3´5´突变型GCTTACGAAT3´3´5´5´异源杂合双链酶切TATGCATACG3´5´3´5´3´5´3´5´TATGCATTCG体外合成RNA探针TATGC5´3´野生型探针264未发生酶切发生酶切电泳分离65缺点：当RNA探针上错配的碱基为嘌呤时，核糖核酸酶切割效率低甚至不切割；分析DNA的一条链，突变检出率为30%；同时分析DNA的两条链，突变检出率为70%；需要制备特异性的RNA探针66

2.杂合双链分析法

（heteroduplexanalysis,HA）

直接在非变性凝胶上分离杂交的突变型-野生型DNA双链。由于突变型和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成单链环形突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应同源双链DNA不同的迁移率。67杂合双链分析（heteroduplexes

analysis）非变性胶电泳5′5′GCTACGAT缺失突变型GCATACGTAT野生型5′3′3′5′3′3′野生型DNA探针与野生型DNA杂交GCATACGTATTATGCATACG5′5′3′3′5′5′3′3′形成异源杂合双链野生型DNA探针与缺失型DNA杂交TATGCATCGCGATGCATA5′3′3′5′5′3′3′5′68缺点：只适合200～300bp的片断;不能确定突变的具体位置;检出率一般只有80%左右。69

3.化学切割错配法

（Chemicalcleavageofmismatch,CCM）

基本原理：将待测含DNA片段与相应的野生型DNA片段或RNA片段混合变性杂交。在异源杂合的双链核酸分子中：

错配的C能被羟胺和哌啶切割，错配的T能被四氧化锇切割，变性凝胶电泳可确定是否存在突变。

70特点：突变检出率高；如使用荧光检测系统，灵敏度较高；可检测长度达2Kb的核酸片段；步骤多、费时、有毒；714.酶促切割错配(enzymemismatchcleavage)酶：T4内切核酸酶VII识别的序列：DNA:DNA异源杂合分子优点：最长检测片段可达1.5kb，省去体外合成RNA探针的步骤缺点：会产生非特异性切割，对错配位点的识别也不是100%72测序：双脱氧自动化序列分析SSCP：单链构象多态性分析RFLP：限制性酶切长度多态性DNA芯片技术AS-PCR技术ASO杂交技术MS-PCRDGGE等73二、基因表达系列分析

(SerialAnalysisofGeneExpression,SAGE)

是一种用于定量、高通量基因表达分析的实验方法(Velculescuetal.,1995)。SAGE原理:

分离每个转录本特定位置的较短单一的序列标签（约9-11个碱基对），这些短的序列被连接、克隆和测序，特定的序列标签的出现次数就反应了对应基因的表达丰度。74Serialanalysisofgeneexpression(SAGE)技术流程反转录酶切连接测序单条测序＝＝对30－40条EST测序分析由于采样量大大提高，可对低表达基因进行分析：基因表达量分析、寻找新基因等等实验步骤较长要求较高75三、基因功能的研究转基因技术基因打靶反义寡核苷酸技术反义RNA技术核酶技术RNA干扰技术基因诱导超表达技术反义技术761.转基因技术

指在生物基因组中带有插入或整合的外源基因，生物个体能将它传给后代，并表达出该基因的生物活性物质，从而使受体生物获得新的性状。77

采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使之发育成个体。

转基因——

被导入的目的基因转基因动物(transgenicanimal)——

目的基因的受体动物78转基因动物操作技术流程

获取外源目的基因含有外源目的基因的重组载体导入生殖细胞或胚胎干细胞选择携带目的基因的细胞，选择体外培养系统和宿主动物转基因胚胎的发育及鉴定筛选所得的转基因动物简明操作步骤79

转基因动物实例一超级奶牛－普通奶牛的三倍大（英国）80转基因动物实例二东北农业大学－国内首例绿色荧光蛋白“转基因”克隆猪

绿色荧光蛋白－猪胎儿成纤维细胞－克隆

81转基因动物实例三转绿色荧光蛋白的兔82转基因动物实例四正在进行转基因山羊的实验

乳汁中分泌人凝血因子IX的转基因山羊上海交通大学医学遗传研究所83justajoke

842.基因打靶(genetargeting)通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，在生物活体内研究该基因的功能。基因敲除(geneknockout)：定向敲除基因敲入(geneknockin)：定向替代85MarrioCapecchi于八十年代末在Utah大学发展起来。实验动物通常是小鼠，被敲除了功能基因的小鼠就称为敲除小鼠(knockoutmice)。基因敲除技术是研究基因功能的一项非常有用的技术(遗传病研究、研究特定基因的细胞生物学活性以及研究发育调控的基因作用）。基因敲除是一套组合技术，包括基因重组、细胞分离培养、转基因等。86基因打靶的必备条件胚胎干细胞(ES细胞)能在体外培养，保留发育的全能性打靶载体Neo（新霉素）阳性筛选标志HSV-tk阴性筛选标志：单纯疱疹病毒(herpessimplexvirus)胸腺嘧啶激酶(thymidinekinase)87基因敲除的基本程序打靶载体的构建打靶载体导入ES细胞：重组置换基因敲除ES细胞注射入胚泡胚泡植入假孕小鼠的子宫中嵌合体的杂交育种8889美国犹他大学MarioR.Capecchi美国北卡罗来纳州大学Oliver

Smithies英国卡迪夫大学MartinJ.Evans2007年诺贝尔生理学或医学奖:基因打靶

903.反义技术91

核酶技术确定基因在疾病中的作用（1）RNA分子，催化核糖体RNA中内含子的自我拼接；除了催化RNA的剪切，还可催化DNA的剪切、RNA的聚合、RNA链的复制等。（2）优点:其底物的碱基配对特异性。核酶与底物结合常形成“发夹”结构或“锤头”结构。（3）设计核酶特异性地结合于靶点，以其本身酶活性进行剪切。92核酶的作用机制

93

与一般的反义RNA相比，核酶具有较稳定的空间结构，不易受到RNA酶的攻击。更重要的是，核酶在切断mRNA后