内毒素及葡聚糖检测

内毒素及葡聚糖检测第一页，共四十六页，2022年，8月28日主要内容来源及结构生物学活性检测的临床应用检测方法及参考范围标本采集及影响因素第二页，共四十六页，2022年，8月28日

内毒素第三页，共四十六页，2022年，8月28日内毒素的生物学活性发热反应1激活血管活性物质的释放2激活凝血和纤溶系统3激活补体4直接或间接损害肝脏5激活白三烯、前列腺素及单核巨噬系统6第四页，共四十六页，2022年，8月28日内毒素的结构特异性多糖核心多糖类脂A外层菌体多糖（O抗原），与细菌侵袭力有关。中层同一种属之间是相同的。内层特殊的糖磷脂，起毒性作用，而无种属特异性。第五页，共四十六页，2022年，8月28日内毒素概述

内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁结构中的脂多糖（LPS），这些成分只在细菌死亡裂解后才释放到菌体外或活菌以发泡形式将其释出。第六页，共四十六页，2022年，8月28日内毒素的有益作用增加机体非特异性免疫力1防御放射性损伤，促进粒细胞生成2增加网状内皮系统功能3抗肿瘤，免疫佐剂作用4第七页，共四十六页，2022年，8月28日内毒素血症产生原因内毒素血症内源性外源性肠道内毒素的吸收1败血症时血中细菌的释放23有效的抗菌治疗后，细菌崩解输入了含有细菌的药物、血液或者体液等。第八页，共四十六页，2022年，8月28日各类疾病内毒素血症的发生率肺炎100%、尿路感染70-80%、腹腔感染72-84%、烧伤85%、急性胰腺炎90%、败血症70%、急性肝炎37-64%、暴发性肝炎58-100%、丙肝60%、胆石症伴急性梗阻性化脓性感染85%、多器官功能衰竭100%。第九页，共四十六页，2022年，8月28日内毒素检测的临床应用在肝胆疾病中的应用1在呼吸系统感染中的应用2在胰腺疾病中的应用3在溃疡性结肠炎中的应用4在全身性细菌感染中的应用5在不明原因发热中的应用6第十页，共四十六页，2022年，8月28日内毒素检测在医院中的应用在医院灭菌制剂检验中应用1对注射器、输液器等医疗器械的内毒素检测2在透析站和血站中的应用3在临床医学研究中的应用4第十一页，共四十六页，2022年，8月28日内毒素血症的临床症状内毒素血症临床症状主要决定于宿主对内毒素的抵抗力。症状和体征有：发热，白细胞数变化，出血倾向，心力衰竭、肾功能减退、肝脏损伤、神经系统症状，以及休克、血压下降、组织灌流不足、缺氧及酸中毒等。

▲最严重的后果：致死性感染性休克，多器官功能衰竭，DIC等。病死率极高。第十二页，共四十六页，2022年，8月28日内毒素的检测方法

鲎试验是1968年由Levin和Bang建立。其原理是利用鲎的变形细胞与微量内毒素产生凝集反应的现象，作为判断试剂中细菌内毒素含量的一种方法。第十三页，共四十六页，2022年，8月28日内毒素的检测方法1.凝胶法：鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来定性检测或半定量内毒素的方法2.浊度法：利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量3.比色法：利用鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底物显色释放出的呈色团的多少而测定内毒素含量4.流式细胞术：测内毒素的量而不是活性5.化学发光测定法第十四页，共四十六页，2022年，8月28日内毒素的检测原理革兰阴性菌脂多糖检测试剂盒（光度法）检测原理：革兰阴性菌脂多糖能激活酶反应主剂中的C因子、B因子、凝固酶原等，引起凝固蛋白原转变成凝固蛋白从而引起吸光度变化，根据检测其溶液吸光度变化对革兰阴性菌脂多糖浓度进行测定。第十五页，共四十六页，2022年，8月28日

第十六页，共四十六页，2022年，8月28日MB-80微生物快速动态检测系统第十七页，共四十六页，2022年，8月28日内毒素检测的参考值检测值﹤10pg/ml,阴性。检测值介于10～20pg/ml之间，临床观察期，建议动态采血检测。检测值﹥20pg/ml，阳性，建议临床结合症状进行治疗。

第十八页，共四十六页，2022年，8月28日检测方法的局限性只能检测革兰阴性菌脂多糖含量，不能区分细菌种属。

第十九页，共四十六页，2022年，8月28日检测样本的采集与保存检测样本：血液采集要求：采样过程要求无菌操作，用专用的无热原真空采血管（肝素类抗凝）。常规病人早上用药治疗前空腹采血/取样（血透患者透析前采血）。样本保存：样本采集后应在3000转/分进行离心，若不能及时检测，应将血浆转移至无热原试管内，在-30℃冰箱中冷冻保存，一周内使用。特殊标本处理：对一般黄疸、溶血、乳糜血标本，稀释2-5倍后进行检测；对于严重的黄疸、溶血、乳糜血标本，应重新采血。第二十页，共四十六页，2022年，8月28日干扰因素1.应用某些抗生素如β-酰胺内酯类、喹诺酮类等患者；2.一些蛋白：阳离子蛋白如溶菌酶、核糖核酸酶A及人免疫球蛋白G均能与内毒素形成细菌内毒素--蛋白复合体，对细菌内毒素有显著的屏蔽作用，而影响测定内毒素结果；3.操作环境及操作过程中的污染，可能造成假阳性。第二十一页，共四十六页，2022年，8月28日(1-3)--D-葡聚糖第二十二页，共四十六页，2022年，8月28日1-3-β-D-葡聚糖本质及特点真菌细胞壁成分，占50%以上1其他微生物、动物及人的细胞不含该成分2用于侵袭性真菌感染的早期诊断3第二十三页，共四十六页，2022年，8月28日(1-3)-β-D-葡聚糖特性1.对热极为稳定，高压21℃并不能使其灭活。在念珠菌和曲霉菌细胞壁中含量较多，对G试验灵敏。2.当真菌进入人体血液或深部组织后，经吞噬细胞的吞噬、消化等处理后，(1-3)-β-D-葡聚糖可从胞壁中释放出来，从而使血液及其它体液中含量增高。当真菌在体内含量减少时，机体免疫系统可将其清除。3.在浅部真菌感染中，(1-3)-β-D-葡聚糖未被释放出来，故其在体液中的量不增高。第二十四页，共四十六页，2022年，8月28日侵袭性真菌感染的定义侵袭性真菌感染(invasivefungalinfection,IFI)定义:指致病性真菌侵犯皮下组织、黏膜、肌肉和内脏器官等所引起的真菌感染性疾病，危害性较大。第二十五页，共四十六页，2022年，8月28日侵袭性肺部真菌感染侵袭性真菌感染的发病率逐年上升,其中又以侵袭性肺部真菌感染最常见,大约占50%～60%。未经及时治疗的肺部真菌感染患者的病死率可高达30%～80%。第二十六页，共四十六页，2022年，8月28日侵袭性肺部真菌感染临床表现：缺乏特异性,多表现为发热、咳嗽、咳痰、咳血、胸闷、呼吸困难等。现状：两高两低一快高院内感染率和病死率，低临床和实验室诊断率，患者病情恶化快。（检测方法相对滞后,早期诊断和治疗仍存在困难,副作用小的新型抗真菌药物价格昂贵,导致病死率高。）第二十七页，共四十六页，2022年，8月28日侵袭性真菌感染的诱因内源性诱因：影响机体抵抗力的各种疾病，如白血病、癌症、结核、肺脓肿、糖尿病、肝脏疾病以及维生素缺乏等。外源性诱因：

▲广谱抗生素，抗肿瘤药物和免疫抑制剂；

▲插管等侵袭性治疗，骨髓和实体器官移植；

▲免疫缺陷综合症。第二十八页，共四十六页，2022年，8月28日侵袭性真菌感染诊断困难的原因诊断困难的主要原因：临床表现不典型，易被基础疾病所掩盖确诊常需侵入性手段获得组织标本，侵入性操作常因患者的病情所限难以实施真菌检测项目开展相对不足或滞后第二十九页，共四十六页，2022年，8月28日第三十页，共四十六页，2022年，8月28日侵袭性真菌感染的特点不产生内毒素和外毒素，致病机理不明；致病力一般较弱，机体免疫低下时发生；感染菌种变化：白色念珠菌感染下降，曲霉菌感染增长趋势上升明显；早期症状无特异性，往往被原发病掩盖，病程长，发现较晚，死亡率高。第三十一页，共四十六页，2022年，8月28日主要可引发侵袭性真菌感染的疾病呼吸系统疾病：肺炎、肺纤维症感染及寄生虫病：肺结核、腹腔内脓肿、AIDS循环系统疾病：脑出血、脑梗塞、硬膜下血瘤术后、胸部大动脉瘤术后内分泌疾病：糖尿病血液及造血器官疾病：再生障碍性贫血、DIC肿瘤类：胃癌，肝癌，肝内胆管癌，肺癌，多发性骨髓瘤，白血病，恶性淋巴瘤第三十二页，共四十六页，2022年，8月28日“G”试验1-3-β-D-葡聚糖可特异性激活鲎变形细胞裂解物中的G因子，引起裂解物凝固，故称G试验。第三十三页，共四十六页，2022年，8月28日G试验检测评价BG值在侵袭性真菌感染临床表现出现之前就已经高于正常值相关报道5例确诊IFI及3例临床诊断的IFI患者，发现BG值升高出现在发热、咳嗽、胸痛等症状和肺部CT检查发现以前。平均早于发热5d早于呼吸道症状10d第三十四页，共四十六页，2022年，8月28日G试验临床应用

1明确诊断（抗真菌药物治疗前）

2治疗效果监测（抗真菌药物治疗后）

3连续2次采血进行G试验第三十五页，共四十六页，2022年，8月28日侵袭性真菌感染的临床检测方法直接培养真菌法--敏感性低，耗时长,培养阳性率低。培养结果是定性的，有些标本采集困难G试验：通过检测(1-3)-β-D-葡聚糖的含量，判断是否有真菌感染。耗时短，灵敏度高，特异性强，定量检测可判断感染严重程度PCR技术：真菌的抗原、抗体及代谢产物的血清学检查和真菌核酸检测第三十六页，共四十六页，2022年，8月28日真菌1-3-β-D葡聚糖检测原理真菌1-3-β-D葡聚糖检测试剂盒（光度法）检测原理：真菌1-3-β-D葡聚糖能特异性激活反应主剂中的G因子、凝血酶原等，发生酶的级联反应从而引起吸光度变化，根据检测其溶液吸光度变化对真菌1-3-β-D葡聚糖浓度进行定量。试剂中添加的两性电解质甘氨酸、氨基糖苷类抗生素及表面活性剂可抑制脂多糖对B、C因子的激活，对革兰阴性菌脂多糖有特异性屏蔽作用。第三十七页，共四十六页，2022年，8月28日MB-80微生物快速动态检测系统第三十八页，共四十六页，2022年，8月28日真菌1-3-β-D葡聚糖参考值检测值﹤60pg/ml,阴性。检测值介于60～100pg/ml之间，临床观察期，建议动态采血检测。检测值﹥100pg/ml，阳性(深部真菌感染)，建议临床结合症状进行治疗。第三十九页，共四十六页，2022年，8月28日检测方法的局限性只能检测真菌1-3-β-D葡聚糖的含量，不能区分真菌种属，不能检测结合菌和隐球菌。第四十页，共四十六页，2022年，8月28日内毒素与β-葡聚糖的检测比较已知能与鲎试剂发生反应的物质有细菌内毒素和真菌1-3-β-D葡聚糖，但它们的反应曲线不一样。内毒素反应曲线为S型特征曲线，而β-葡聚糖反应曲线为经过0点的斜线。第四十一页，共四十六页，2022年，8月28日念珠菌显色培养基的菌落颜色对于念珠菌血症,G试验检测是首选检查热带念珠菌----灰蓝色白色念珠菌----绿色克柔念珠菌----粉红色光滑念珠菌----紫红色第四十二页，共四十六页，2022年，8月28日标本采集及保存检测样本：血液、肺细胞灌洗液采集要求：1.采样过程要求无菌操作，用专用的无热原真空采血管；2.常规病人早上用药治疗前空腹采血，血透析患者透析前采血第四十三页，共四十六页，2022年，8月28日标本采集及保存及时送检，及时检测：2-3h内检测不合格标本：严重黄