【课件】1.2微生物的培养技术和应用-微生物的选择培养和技术-（人教版2019选择性必修3）

第2节微生物的培养技术和应用二、微生物的选择培养和技术1、实例：DNA多聚酶链式反应(PCR)是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温（93℃）的DNA聚合酶。什么是TaqDNA聚合酶？从哪里获得？如何获得Taq细菌?2、实验室中微生物的筛选原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。一、选择培养基选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。稀释涂布法是将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个菌落。稀释涂布平板法二、微生物的选择培养微量移液器滴灼涂稀释103倍稀释104倍稀释105倍各梯度分别涂布3个平板1个不涂布作空白对照待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放在30-37℃恒温箱中培养1-2d，平板上就可以观察到单菌落。常用方法：1、稀释涂布平板法（也叫活菌计数法、间接计数法）原理：成功统计菌落数目的关键是恰当的稀释度。当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。稀释涂布平板法、显微镜直接计数法、滤膜法三、微生物的数量测定②为了保证结果的准确，一般选择菌落数在30—300的平板进行计数，若设置的重复组中结果相差太远，意味着操作有误，需重新实验。

计算公式每克样品中的菌落数＝×M其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。①设置重复组，目的是增强实验的说服力与准确性。将待测样品经一系列10倍稀释，然后选择三个稀释度的菌液，分别取0.1ml接种到已制备好的平板上，然后用无菌涂布器将菌液涂布在整个平板表面，放在适宜的温度下培养计数菌落数。操作为使结果接近真实值，可将同一稀释度菌液加到三个或三个以上的平板上，经涂布培养，计算出菌落平均数。

注意事项①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30——300的平板上进行计数。②为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。？是因为当2个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数表示而不用活菌数来表示。④涂布平板法所选择的稀释度很重要，一般以三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌落数在50个左右为最好。思考题1.想一想，如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？答：统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板菌落数的平均值，然后按课本旁栏的公式进行计算。例：某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均值为234，那么每克样品中的菌落数是(涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL)多少？每克样品中的菌落数=(C÷V)×M=(234/0.1)×106＝2.34×1092、显微镜直接计数法（1）原理：此法利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物数量。（2）方法：用血细胞计数板计数。计数板是特制的载玻片，其上有特定的面积为1mm2，高为0.1mm的计数室，一个计数室又被分成25个（或16个）中格，每个中格再被分成16个（或25个）小格，每个计数室都由400个小格组成。（3）操作：将稀释的样品滴在计数板上，盖上盖玻片，然后在显微镜下计数4~5个中格中的细菌数，并求出每个小格所含的细菌数，再按计数公式求出每毫升样品中所含的细菌数。（4）计算公式（5）缺点：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；3、滤膜法以测定饮用水中大肠杆菌的数目为例。将已知体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放在伊红美蓝培养基上培养。在该培养基上，大肠杆菌的菌落呈现黑色。可以根据培养基上黑色菌落的数目，计算出水样中大肠杆菌的数量。大肠杆菌菌落呈黑色或深紫色,有金属光泽原理：伊红—美蓝培养基(EMB)是鉴别培养基，可以用来检测自来水中的大肠杆菌是否超标，因为大肠杆菌的代谢产物与伊红—美蓝结合，使菌落呈深紫色或黑色并带有金属光泽，使大肠杆菌的菌落显示出来，并没有促进大肠杆菌的生长和抑制其他微生物的生长。到社会中去练习：我国规定每升饮用水中大肠杆菌不能超过3个。某兴趣小组尝试对某品牌饮用水的大肠杆菌含量进行检测，操作简图如图甲，伊红美蓝培养基配方如图乙。回答下列相关问题：（1）图甲中滤膜的孔径应

（“大于”或“小于”）大肠杆菌。受此启发，对某些不耐高温的试剂可以怎样除菌？（2）配制图乙中的基础培养基时，除了水分、无机盐以外，还应加入

（一种营养成分），以及

。伊红美蓝培养基上生长的大肠杆菌菌落呈现

。（3）该小组通过统计黑色菌落的数目，计算出单位体积样品中大肠杆菌数目。理论上他们的统计值要比实际

（“偏高”或“偏低”），理由是

？

（4）如图所示的操作是培养基配置过程中的倒平板，该操作的正确使用顺序是

（用图中的序号和箭头表示）。③步骤操作的目的是

。小于用滤膜过滤除菌氮源琼脂黑色偏低两个或多个大肠杆菌连在一起时，平板上只能观察到1个菌落④→①→②→③既可使培养基表面的水分更好地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染1、尿素的利用尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、细菌利用尿素的原因土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶CO(NH2)2脲酶+CO22NH3+H2O四、探究实践土壤中分解尿素的细菌的分离与计数（一）课题背景3、常见的分解尿素的微生物芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。（二）课题目的①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌在以尿素为唯一氮源的选择培养基上，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，从而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。（三）实验原理（四）实验流程土壤取样、制备培养基、样品稀释、取样涂布、微生物培养、观察并记录结果、细菌计数、对分离的菌种做进一步鉴定土壤取样从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。（五）实验的具体操作步骤如下制备培养基设计一种选择培养基，用尿素作为唯一氮源，可以将分解尿素的细菌分离出来。15.0g琼脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO4土壤中分解尿素的细菌的分离与计数培养基配方：①从物理性质看此培养基属于哪类？从功能上属于哪类培养基？该培养基是否有选择作用？固体培养基②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：葡萄糖、尿素氮源：尿素选择培养基③该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？此培养基只是用尿素作为唯一氮源，培养基的其它营养成分基本相同。将10g土样加入盛有90mL无菌生理盐水的锥形瓶中（锥形瓶体积为250mL），充分摇匀，吸取上清液1mL，转移至盛有9mL的生理盐水的无菌大试管中，依次等比稀释至107稀释度。

样品稀释由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为103～107。每个稀释度下需要3个选择培养基，1个基础培养基，因此共需要15个选择培养基，5个基础培养基。此外，还需要准备8个灭菌的试管和1个灭菌的移液管。◆应在火焰旁称取土壤10g。◆在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行为什么分离不同的微生物采用不同的稀释度？原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板。测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。微生物的种类土壤稀释倍数目标分离土壤中所有细菌104、105、106平板上的菌落数应为30～300个，便于准确计数。分离土壤中的放线菌103、104、105分离土壤中的真菌102、103、104分离土壤中的尿素细菌104、105、106、107按照由107～103稀释度的顺序分别吸取0.1mL进行平板涂布操作。按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管。

取样涂布◆如果得到了2个或2个以上菌落数目在30——300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。◆实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。

微生物的培养与观察培养不同微生物往往需要不同培养温度。微生物的种类培养温度培养时间观察时间细菌30～37℃1～2d①每隔24h统计一次菌落数，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。②仔细观察并记录菌落的（形状、大小、隆起程度和颜色等）特征。霉菌25～28℃3～4d放线菌25～28℃5～7d将涂布好的培养皿放在某（如：30℃）温度下培养。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生。观察记录比较基础培养基和选择培养基中菌落的数量、形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，并做好记录。

细菌计数当菌落数目稳定时，选取菌落数在30～300的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。对分离的菌种做进一步鉴定挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含酚红培养基的斜面中，观察能否产生如图的颜色反应。因为在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。

进一步探究五、结果分析与评价（一）培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落

对照培养基在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。基础培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。（二）是否获得了某一稀释度下菌落数为30-300的平板？如果得到了2个或2个以上菌落数目在30～300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。如果学生选取的是同一种土样，统计的结果应该接近。如果结果相差太远，需要进一步分析产生差异的原因。（三）你的统计结果与其它同学的统计结果是否接近？如果相差很大，可能是什么原因造成的？拓展应用1：反刍动物，如牛和山羊，具有特殊的器官——瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能以尿素作唯一氮源。请你设计一个实验，从瘤胃中分离出能够分解尿素的微生物。提示：反刍动物的瘤胃中含有大量的微生物，其中也包括分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基外，还应参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。下列哪一项操作达不到实验目的？A.以尿素为唯一氮源B.以葡萄糖作为碳源C.将培养基调至酸性D.培养环境有充足氧气拓展应用2：分解纤维素的微生物的分离纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是含量最丰富的多糖类物质。植物的根、茎、叶等器官都含有大量的纤维素。

棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物。土壤中某些微生物能够产生

,把纤维素分解为

，后再利用。纤维素酶葡萄糖2.纤维素酶

纤维素酶是一种

，一般认为它

，即

，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。纤维二糖C1酶、Cx酶葡萄糖苷酶葡萄糖纤维素复合酶至少包括三种组分C1酶、和葡萄糖苷酶CX酶滤纸崩溃法3、纤维素分解菌的筛选（1）筛选纤维素分解菌的方法______________。该方法可以通过________反应直接筛选。刚果红染色法颜色（2）原理：刚果红是一种染料，它可以与纤维素形成红色复合物，但并不和纤维二糖、葡萄糖发生这种反应。在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后刚果红—纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这样我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。可根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌1.实验原理纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即CX酶、

C1酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。刚果红染色法：这种方法能够通过颜色反应直接对微生物进行筛选.

刚果红是一种染料，它可以与纤维素形成红色复合物，但并不和纤维二糖、葡萄糖发生这种反应。当纤维素被纤维素酶分解后刚果红—纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解为中心的透明圈。这样我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌.现在要从土壤中分离纤维素分解菌，请你给出详细的实验方案。实验设计土壤取样选择培养梯度稀释将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上挑选产生透明圈的菌落2.实验流程3.实验步聚（1）土壤取样（2）选择培养选择培养基的制备选择培养的操作（3）梯度稀释制备菌悬液制备鉴别纤维素分解菌的培养基（4）将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上倒平板涂布平板刚果红染色法（5）挑选产生透明圈的菌落取样的环境是怎样的，作出这种选择的理由是什么？（为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？）

选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等等。生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环境。（1）土壤取样人工设置适宜环境，使纤维素分解菌相对聚集。将滤纸埋在土壤中有什么作用？将纸埋于深约10cm的腐殖土壤中。你认为滤纸应该埋进土壤多深？为什么？根据树叶腐烂程度推测出的，一般埋10cm左右，能使纤维素分解菌相对聚集。其次，纤维素分解菌是一类细菌，有的好氧，有的不好氧，所以这个深度不会太深或太浅。选择培养的目的：增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物制备选择培养基a、配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？b、这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如何进行选择的？c、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用？是液体培养基，原因是配方中无凝固剂有选择作用，本配方中的碳源是纤维素粉，为唯一碳源，所以能分解纤维素的微生物可以大量繁殖。用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照或者将纤维素改为葡萄糖。（2）选择培养

d、配方中的酵母膏也能够提供少量的碳源，会对纤维素分解菌的培养造成怎样的影响？由于酵母膏的含量极少，其他微生物也能在该培养基中生长繁殖，但很少。然而，只有以纤维素为碳源的微生物才能大量繁殖。在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此选择培养可以起到“浓缩”所需微生物的作用。为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？具体操作选择培养基的制备按配方配制，在250ML锥形瓶中装入30ML培养基，用纱布做成瓶塞，瓶塞外包裹包装纸，扎紧，高压蒸汽灭菌。选择培养的操作称取土样20g，在无菌条件下，将土样加入装有30ml选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下振荡培养1～2天，直至培养液变浑浊。吸取一定量的培养液，转移至新的选择培养基中，同样培养至变浑浊。振荡培养的目的？增加溶解氧，为目的菌提供O2制备鉴别纤维素分解菌的培养基（4）将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上培养基组成提供的主要营养物质CMC-Na(水溶性羧甲基纤维素钠)5~10g碳源酵母膏1g碳源、氮源、生长因子KH2PO40.25g无机盐土豆汁100mL碳源、生长因子琼脂15g凝固剂上述物质溶解后，加蒸馏水定容至1000mL氢元素、氧元素鉴别纤维素分解菌的培养基配方

制备菌悬液按照课题1的稀释操作方法，将选择培养后的培养液进行等比稀释，稀释最大倍数到106（3）梯度稀释倒平板涂布平板将稀释度为104～106的菌悬液各取0.1ml涂布在培养基上，30℃倒置培养，至菌落长出。每个稀释度下涂布3个平板，设置对照。刚果红染色法