讲解分光光度法

分光光度法Spectrophotometry分光光度法概念：是利用物质分子对光的选择性吸收而建立的分析方法。也叫吸光光度法。是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的一项技术。定性定量定量----单组分、多组分特点：灵敏度高、精确度高、操作简便、快速。对于复杂的组分系统，无须分离即可检测出其中所含的微量组分的特点。第一节

物质的吸收光谱一、基本概念复色光：不同波长组成的光单色光：单一波长的光可见光：380~780nm紫外光：200~380nm互补色光：按适当的强度比例混合可成白光的两种颜色的光白光蓝黄红青橙紫青蓝绿物质的吸收光谱互补色光示意图二、物质对光具有选择性吸收若溶液选择性吸收某种颜色的光，则溶液呈吸收光的互补色光。如硫酸铜溶液选择吸收黄色光，故溶液呈蓝色物质的吸收光谱M(基态）＋hM*(激发态)选择性吸收：⊿E=h光子h=hc/⊿E不同物质，⊿E不同，选择吸收光子能量也不同，即吸收的波长不同三、吸收光谱max(2)(1)A物质的吸收光谱A:吸光度，物质对单色光的吸收程度吸收光谱：A~作图

C2﹥C1吸光度最大处的波长为最大吸收波长，用max表示。max是定性鉴别物质的基础不同浓度的溶液，max不变，浓度与峰值成正比，这是进行定量分析的依据。一般用max单色光测定第二节

分光光度法基本原理一、Lambert-Beerlaw透光率T

：透射光强度与入射光强度之比

T=It/I0吸光度A：透光率的负对数A=-lgTI0=Ia+It

分光光度法基本原理一、Lambert-Beer定律1、Lambert定律

一定条件下，某溶液吸光度与单色光通过的液层厚度b成正比。

A=k1b2、Beer定律

一定条件下（液层厚度固定），单色光通过溶液时，吸光度与溶液的浓度成正比。

A=k2C3.Lambert-Beer定律

A=bc1A=abc2=aM分光光度法基本原理:摩尔吸光系数L.mol-1.cm-1b:液层厚度cmC1:量浓度mol.L-1a:质量吸光系数L.g-1.cm-1C2

:质量浓度g.L-1(a),溶液对入射光吸收。

>103,可进行分光光度分析摩尔吸光系数ε的讨论（1）吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数（2）不随浓度c和液层厚度b的改变而改变。在温度和波长等条件一定时，ε仅与吸收物质本身的性质有关，与待测物浓度无关；（3）同一吸光物质在不同波长下的ε值是不同的。在最大吸收波长λmax处的摩尔吸光系数，常以εmax表示

εmax表明了该吸收物质最大限度的吸光能力。

例：浓度为0.150mmol/L某化合物(Mr=251)溶液，在480nm波长处用2.00cm吸收池测得透光率为39.8%,求、a.解：=Acb=-lgTcb=-lg0.3980.150×10-3×2.00=1.33×103L.mol.cm-1分光光度法基本原理一、Lambert-Beer定律a=/M=1.33×103251=5.30L.g-1.cm-1例：某有色溶液在1.00cm吸收池中，测得其透光率T=60%，若改用2cm的吸收池时，其T为？

解：A=kb=-lgTb=1.00时A1=-lg0.6b=2.00时A2

＝2A1

＝-2lg0.6=-lg0.36

T=0.36练习题：1.在波长为508nm处，以邻二氮菲光度法测定某元素，该元素的溶液浓度为2.5×10―4g/L，吸收池厚为2.0cm，测得其吸光度为0.190，已知该物质的ε为21223.0，试计算该元素的相对分子质量。2.称钢样1.500g，用酸溶解后，以过硫酸钾将其中的锰氧化成高锰酸根，转移到100mL容量瓶内，稀释至刻度后，用1.0cm吸收池在520nm处测得其吸光度为0.620，试计算试样中的锰含量（ε=2235、MMn=54.94）第三节可见分光光度法一、分光光度计光源单色器吸收池检测器信号放大器显示器二、单组份测定方法（一）、标准曲线法分光光度计的基本结构光源单色光器吸收池检测器显示钨丝灯可见光源350~1000nm氢灯氘灯紫外光源200~360nm棱镜衍射光栅玻璃比色杯石英比色杯硒光电池光电管光电倍增管玻璃——能吸收UV光，仅适用于可见光区。石英——不能吸收紫外光，适用于紫外光区。将光信号转变为电信号的装置。记录装置：讯号处理和显示系统。AC0取标准品配置一系列不同浓度的标准溶液，置于液层厚度相同吸收池，测定相应吸光度，以A~C作图，得一条通过原点的直线Beer’slaw当,b等一定，A与C成正比，A=KC相同条件下，测定样品吸光度Ax,在标准曲线上查出对应的被测物浓度CxAxCx可见分光光度法（一）标准曲线法:标准曲线可见分光光度法（一）标准曲线法:用空白液(参比液)对仪器进行校正,以消除溶剂、显色剂对光的吸收，以及光在吸收池中的散射和反射等。标准曲线偏离Beer’slawACA—C线性差，出现弯曲（1）溶液中吸光物质不稳定（2）单色光纯度差物理、化学原因可见分光光度法（二）、标准对照法配置一个与被测物浓度相近的标准溶液Cs，在max附近处测出As,则As=kCsAx=kCxCx=AxAsCs适于个别样品，误差较大。只有在测定的浓度区间内溶液完全遵从郎伯-比尔定律。Cs和Cx相近时结果准确。可见分光光度法（三）、增量法如果标准试样和未知试样不能保持一致时，采用增量法。具体方法：

把未知试样溶液分成体积相同的若干份溶液（不少于四份），其中一份不加入被测组分的标准溶液，在其他几份中都加入不同量的标准溶液，然后在相同条件下，测定各试液吸光度，并绘制吸光度对增量的工作曲线。A△C（增量值）Cx····可见分光光度法（一）、显色反应选择（1）灵敏度高

>104

（2）选择性好只与被测物显色（3）生成的有色物稳定、组成一定（4）显色剂在测定处无明显吸收第四节

显色反应及显色条件的选择1、显色剂用量通过实验测定，合适用量在a~b之间（平坦区）C显色剂Aab2、溶液酸度酸度过大---酸效应Mn++nHL

MLn＋nH+酸度过小—水解效应Mn++nOH-M(OH)n（二）、显色条件的选择作吸光度A----PH曲线来确定显色反应及显色条件的选择一般加缓冲液，控制溶液酸度（较佳酸度由A-pH实验曲线确定)3、溶液酸度磺基水杨酸离子Sal2-与Fe3+形成配合物pH配合物颜色1.8~2.5[Fe(Sal)]+

紫色4~8[Fe(Sal)2]-橙色8~11[Fe(Sal)3]3-

黄色﹥12Fe(OH)3显色反应及显色条件的选择4、显色时间作吸光度A与时间曲线，确定时间5、干扰离子的掩蔽掩蔽：借助一定化学反应（加入掩蔽剂），不经分离而消除干扰的过程。如配合，氧还反应6、显色温度（三）、显色剂无机显色剂：配位不稳定，灵敏度和选择性不好，应用不多有机显色剂螯合物-------------------重要课题一般有生色团和助色团不饱和键孤对电子（影响生色团对光的吸收）有机显色剂分类1、偶氮类2、三苯甲烷类3、三元（或多元）配合物的应用稳定、灵敏度、选择性好，改善显色条件Ti-EDTA-H2O2（四）、吸光度测量条件的选择1、入射光波长选择一般选maxmaxA但共存物或显色剂等在max处也有一定吸收时，应选max附近或第二大被测物、干扰物吸收光谱类型：纯溶剂---待测物质与显色剂的产物有吸收试剂空白---除式样外的其他溶剂试样溶液----显色剂无吸收，其他组分有吸收，但不参与显色反应2、参比溶液的选择（四）、吸光度测量条件的选择3、吸光度读数范围的选择（四）、吸光度测量条件的选择两式相除：以有限值表示不同透光率时测定浓度的相对误差ΔcB/cB(ΔT=0.01)

T/%95908070605036.83020105220.610.75.64.03.32.92.72.83.24.36.513.0测定相对误差与透光率的关系在T=36.8%(A=0.434)时，浓度测定的相对误差最小。在实际测定时，常将吸光度控制在0.2~0.7(T=20%~65%)之间。一、多组分的测定a不重叠b重叠第五节、吸光光度法的应用了解例：用光程为1cm的吸收池，在两个测定波长处测定含有K2Cr2O7和KMnO4两种物质溶液的吸光度。混合物在450nm处的吸光度为0.38，在530nm处的吸光度为0.71，求混合物的组成。已知1.010-3mol/L的K2Cr2O7在450nm处吸光度为0.20，而在530nm处为0.05；1.010-4mol/L的KMnO4在450nm处无吸收，在530nm处吸光度为0.42。了解KMnO4K2Cr2O7450nm530nm530nm第五节、吸光光度法的应用酸碱解离常数的测定配合物组成及稳定常数的测定双波长分光光度法了解第六节紫外分光光度法可见光：380~780nm紫外光：200~380nm可见分光光度法：只能测定有色或与显色剂发生显色的物质；紫外分光光度法：可测定在近紫外区（200~380nm）有特征吸收的任何物质(有无颜色均可)。了解一、751-G型分光光度计P284/13-12光源：氢灯、钨灯紫外光不能透过玻璃,用石英二、紫外分光光度法的应用（一）、定性鉴别比较max,(max)ora(max)紫外分光光度法醋酸可的松23839.0醋酸泼尼松23838.5maxa(238)了解（二）、定量测定光的吸收符合lambert-Beer定律例：解：已知a(361)=20.7L.g-1.cm-1b=1.00cm