分子生物学第09章DNA分子标记技术

9.1基于Southern杂交技术的分子标记9.2随机（或半随机）引物分子标记技术9.3序列标志位点技术9.4分子标记的应用领域9DNA分子标记技术DNA分子标记的定义

DNA分子标记就是在同一物种不同个体间DNA序列上的差异，某一特定的差异可以通过实验的方法检测出来，测出来的特定差异就是特定的DNA分子标记。利用不同的实验方法可以得到许许多多的DNA分子标记，这些DNA分子标记表明了这些个体间遗传物质上的差异。遗传标记的发展形态标记→

细胞学标记（染色体多态性）→

蛋白质标记（同工酶，分子标记）→

DNA标记（分子标记）RFLP

分析

RFLP（restrictionfragmentlengthpoly-morphism）称为限制性片段长度多态性。当用某种限制性内切酶处理不同生物个体来源的DNA时，由于个体间DNA序列的差异，所产生的切割片段长度和数量可能不同，利用凝胶电泳可以将这些片段分离并观察到差异，这种差异就是RFLP。RFLP

分析

RFLP产生的差异带可以作为分子标记，用于遗传学的研究。当一个生物有多条染色体，且DNA分子很大时，用一种限制性内切酶切割出的DNA片段太多，电泳后的条带无法分辨。

使用某一特定序列的标记探针，与电泳分离的片段进行Southern杂交，再显示出杂交带，可以大大减少被观察条带的数目，便于不同生物个体间的比较和找出差异带。RFLP

分析

换不同的限制性内切酶切割，配合不同的标记探针，可以得到数目多得惊人的条带，从而找到很多的分子标记。这些分子标记与表型标记一样，可以用于遗传学的研究。但分子标记没有显隐性之分，都是共显性的。采用一种探针

作6

个栽培品种的RFLP分析RFLP所用探针的来源

RFLP分析的效率依赖于选择合适的探针。由于用能探测重复序列的探针探测出的片段太多，难以比较，所以探针一般来自单拷贝或低重复序列。常用的RFLP探针主要来源于随机基因组克隆和cDNA克隆。RFLP所用探针的来源

由于基因组DNA中甲基化一般很少在表达基因中发生，故用对甲基化敏感的限制酶切，可得到长度为1～2kb的DNA片段，它们是单拷贝或低重复序列，用这些片段制成文库，即可用作RFLP探针。

如果用cDNA克隆作探针，最好制备来自生物整体mRNA的cDNA文库。RFLP标记的共显性什么是多态性

多态性是在不同个体之间比较得到的差异带，来自于一个个体本身的长短不等的片段不是多态性。RFLP标记的优点1.RFLP标记无表型效应，不受环境条件和发育阶段的影响。因此可在特征性状远未出现之前就可以知道其基因型。2.

RFLP标记在等位之间是共显性的，因此不受杂交方式的影响。不管是正交、反交、回交，总是在F1代中含有两亲本各一组染色体的片段之和。3.用不同探针可以探测出不同的RFLP标记，标记的密度远远超过以性状为基础的图谱。RFLP

的不足

虽然RFLP分子标记有这些优点，但实验步骤较多，费工费时，费用也高，使其应用受到一定的限制。

要使RFLP在指导遗传育种中发挥作用，还必须将RFLP与已知性状联系起来，仅有RFLP标记图使用价值不大。可变数量串联重复（VNTRs）

在真核生物基因组中有小卫星和微卫星序列存在，它们是短序列（核心序列）高度重复的序列，在不同生物个体间，某一座位上的核心序列重复的次数有很大差异，并且这些重复序列有多座位性，因此形成了高度的多态性。用某种高度重复序列的核心序列作探针，测定其RFLP，得到电泳后的杂交图谱，这种图谱称为指纹图谱，可以用来鉴别个体、亲子鉴定等。VNTR一例Thecauseofthevariationbetweenindividualgenomesatmicrosatellitesorminisatellitesisthatindividualalleleshavedifferentnumbersoftherepeatingunit.Forexample,oneminisatellitehasarepeatlengthof64bp,andisfoundinthepopulationwiththefollowingdistribution:

7%18repeats11%16repeats43%14repeats

36%13repeats4%10repeatsVNTR差异带的检测父母子女间VNTR的检测结果VNTR应用举例

用33.15（探针名）进行白种人的DNA指纹分析时，两个无血缘关系的个体具有相同DNA指纹图谱的概率为3×10－11，而当把33.15和33.6两个探针取得的结果综合分析时，两个个体指纹图谱相同的概率更是降低到5×10－19。随机扩增多态DNA（RAPD）

RAPD（randomlyamplifiedpolymorphicDNA）称为随机扩增DNA多态性。它是利用随机引物（通常为10个核苷酸）对不同生物个体基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物经电泳分离，溴化乙锭染色，显示出扩增产物的多态性。不同个体间差异的条带可以作为分子标记。两个不同油菜品系的RAPDRAPD的特点虽然对具体的一个引物而言其检测DNA多态性的位点是有限的，但是当采用一组引物时，检测区域几乎可以覆盖整个基因组，从而得到整个基因组DNA的多态性。RAPD的特点是操作简便迅速，不需要标记探针。只要有一套随机引物就能对任何物种进行RAPD操作。RAPD标记也必须与表型相联系才能发挥指导遗传育种的作用。MAAP技术比较

DAFAP-PCRRAPD引物长度(nt)5～1520～349～10引物浓度(mmol/L)3～3030.3典型扩增产物条带

10～1003～501～10分辨率

高

中等

低分离胶

聚丙烯酰胺

聚丙烯酰胺

琼脂糖显色

银染

放射性标记

溴化乙锭染色严谨度

低或高

低和高

低(Multiplearbitraryampliconprofiling)DAF：DNAamplificationfingerprinting

AP-PCR：arbitrarilyprimedpolymerasechainreaction

MAAP结果比较AFLP

AFLP（amplifiedfragmentlengthpolymor-phism,扩增酶切片段多态性）又称为SAP（Specificamplifiedpolymorphism,专一扩增多态性），它结合了RFLP和PCR二者的优点，经过酶切和用特异引物扩增，检测DNA的多态性。由于退火温度高，结果重复性好，具有RAPD无法比拟的优越性。它是一种高效的分子标记，可用来构建高密度的遗传图谱。

AFLP

指纹技术

先用两种限制性内切酶（A和B）对基因组DNA切割，得到两个粘性末端为A－A、A－B、B－B三种片段。将A和B两种接头加到这些片段的两端，再用相应的A和B引物对这些片段进行PCR扩增，只有A－B片段可以被扩增。扩增产物用电泳检测其多态性。通过换用不同的限制酶及不同的引物，可以控制扩增条带的数目，检测不同的分子标记。图9－5AFLP指纹技术用于AFLP的人工接头

和引物举例

EcoRⅠ适配器：

CORE

ENZ

↓

5’-CTCGTAGACTGCGTACC

--GAATTC--

CAT

CTGACGCAT

GGTTAA-5’

--CTTAAG--

↑EcoRⅠ端

引物：

CORE

ENZ

EXT

5’-GACTGCGTACCAATTCNNN↑用于AFLP的人工接头

和引物举例

MseⅠ适配器：

CORE

ENZ

↓

5’-GACGATGAGTCCTGAG--TTAA--

TACTCAGGACTCAT-5’--AATT--

↑

MseⅠ端引物：

CORE

ENZ

EXT

5’-GATGAGTCCTGAGTAANNNAFLP对酶切位点的要求

AFLP一般采用双酶切，一个酶切点多（识别4碱基），另一个酶切点少（识别6碱基）。切点多的酶产生较小的片段，切点少的酶能够减少可扩增片段的数目。这两种酶都必须产生粘性末端。如果用EcoRⅠ（识别6碱基）和MseⅠ（识别4碱基）组合，则产生的酶切片段有三种：即MseⅠ/MseⅠ、EcoRⅠ/MseⅠ、EcoRⅠ/EcoRⅠ。如果按酶切位点随机分布来算（256，4096），MseⅠ/MseⅠ片段占90%以上，EcoRⅠ/MseⅠ片段为EcoRⅠ酶切位点数的两倍，而EcoRⅠ/EcoRⅠ几乎没有。AFLP对引物的要求

引物分为三个部分，分别为CORE、ENZ、EXT，其中CORE与人工接头中的CORE互补，ENZ与粘性末端序列互补，EXT为选择性碱基。引物一般16到25个碱基，引物3’端的选择性碱基每增加1个，谱带数减少。而选择性碱基GC含量越高，产生的谱带数越少，所以通过调整选择性碱基的数目和种类，就能灵活地调节扩增谱带数。随着选择性碱基的增加，引物与模板的错配率也相应增加，为了控制错配率，选择性碱基一般为1～3个。AFLP的PCR扩增

对于较复杂的基因组来说，AFLP的PCR扩增可分两步进行，第一步预扩增一般采用2种只带1个选择性碱基的引物，引物不被标记，扩增后稀释10倍，取少量作为第二次扩增的模板，这样既为第二步扩增提供了充足的模板，又对模板起到了选择性纯化的作用，第二次扩增采用带有2～3个选择性碱基的引物，引物被标记，这样可以提高扩增的特异性。用EcoRI和MseI引物只扩增EcoRI-MseI片段ⅠⅡⅢⅣABCABCABCABC引物组合Ⅰ：EcoRI+C/MseI+ACⅡ：EcoRI+C/MseI+CAⅢ：EcoRI+T/MseI+AGⅣ：EcoRI+T/MseI+ATA：标记EcoRI引物B：标记MseI引物C：标记MseI引物，但不加

EcoRI引物只扩增EcoRI-MseI片段的原因(i)TheMseIprimerhasalowerannealingtemperaturethantheEcoRIprimer,makingamplificationofMseI-MseIfragmentslessefficientcomparedwithEcoRI-MseIfragmentsundertheconditionsused.WehaveindeedobservedstrongeramplificationofMseI-MseIfragmentsusinglongeroralternativeMseIprimersandadapters.只扩增EcoRI-MseI片段的原因(ii)TheMseI-MseIfragmentshaveaninvertedrepeatattheends,duetothefactthattheyareamplifiedbyasingleprimer.Therefore,astem-loopstructuremaybeformedbybase-pairingoftheendsofthefragments.whichwillcompetewithprimerannealing.ThisisalsoconfirmedbytheobservationthatonlylargerfragmentswereamplifiedinAFLPreactionswhenonlytheMseIprimerwasadded.Formationofastem-loopstructurewillbemoredifficultintheselargerfragments.引物5’端以G开头的原因AnimportantfeatureoftheAFLPprimersisthatallprimersstartwitha5’guanine(G)residue.Wehavefoundthata5’G-residueintheunlabeledprimeriscrucialtopreventthephenomenonofdoublebands.Thedoublebandsappearedtoresultfromincompleteadditionofanextranucleotidetothesynthesizedstrands.ThisterminaltransferaseactivityoftheTaqpolymeraseisquitestrong.

Weconcludefromourresultsthatthisterminaltransferaseactivityismoststrong(almost100%ofthesynthesizedstrands)whenthe3’nucleotideofthesynthesizedstrandisacytidine(C).

引物3’端选择性碱基数目对扩增特异性的影响ⅠⅡⅢABCDABCDABCD引物组合Ⅰ：EcoRI+A/MseI+CTCAⅡ：EcoRI+A/MseI+CTGCⅢ：EcoRI+T/MseI+CTCAA：MseI引物带1个选择性碱基B：MseI引物带2个选择性碱基C：MseI引物带3个选择性碱基D：MseI引物带4个选择性碱基序列标志位点技术

序列标志位点（sequencetagsites，STS）技术是一类基于特定引物序列形成的，利用PCR技术进行的分子标记技术。

SSR是序列标志位点技术中的一种，它以某一微卫星座位两侧的单一序列设计引物，扩增这个微卫星位点的序列，然后电泳检测产物的大小。由于在不同生物个体中这个座位核心序列的重复次数可能不同，同一个体的两条染色体的这个座位核心序列的重复次数也可能不同（杂合体），这个座位有许多不同长度的等位“基因”（复等位“基因”）。SSR就是检测不同个体间等位“基因”在长度上的差异。图9－6微卫星序列长度多态性测定图9－7大豆ATT5SSR位点14个等位基因的大小单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphism,SNP)

SNP是指基因组内DNA某一特定位置的核苷酸存在置换、插入、缺失等变化，而且其中最少有一种等位基因在群体中突变频率不小于1%。SNP一般以替换为主，颠换与转换之比为1:2。转换（transition）：用另一种嘌呤碱基代替原有的嘌呤碱基，或用另一种嘧啶碱基代替原有的嘧啶碱基。颠换（transversion）：嘌呤碱基被嘧啶碱基所替代或嘧啶碱基被嘌呤碱基所替代。SNP的研究状况

目前人类基因组研究中SNP的研究最为广泛。大多数SNP对蛋白质无直接的影响，因为绝大多数的SNP位于非编码区。目前已有的人类基因组SNP图谱中共有142万个SNP，但只有约4.23%的SNP位于外显子内。

除此，在果蝇、鸡、犬类、猪、绵羊、牛等动物上也开展了SNP研究。在植物中展开SNP广泛研究的种类则较少，近几年仅在玉米、大麦、小麦、番茄、水稻等农作物上开展了此项工作。

编码区内SNP的意义

在基因组DNA中，任何碱基均有可能发生变异，因此SNP既有可能在基因序列内，也有可能在基因以外的非编码序列上。总的来说，位于编码区内的SNP（codingSNP，cSNP）比较少，因为在外显子内，其变异率仅及周围序列的1/5。但它在遗传性疾病研究中却具有重要意义，因此cSNP的研究更受关注。SNP的影响

从对生物的遗传性状的影响上来看，cSNP又可分为2种：

一种是同义cSNP（synonymouscSNP），即cSNP所致的编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的含义相同。

另一种是非同义cSNP（non-synonymouscSNP），指碱基序列的改变可使以其为蓝本翻译的蛋白质序列发生改变，从而影响了蛋白质的功能，这种改变常是导致生物性状改变的直接原因。cSNP中约有一半为非同义cSNP。SNP用作遗传标记的优点

SNP用作遗传标记具有以下优点：（1）SNP在人群中是二等位基因性的，在任何人群中其等位基因频率都可估计出来。（2）它在基因组中的分布较微卫星标记广泛得多。（3）与串联重复的微卫星位点相比，SNP是高度稳定的，尤其是处于编码区的cSNP，而串联重复的微卫星位点的高突变率容易引起对人群的遗传分析出现困难。SNP用作遗传标记的优点（4）部分位于基因内部的SNP可能会直接影响产物蛋白质的结构或基因表达水平，因此，它们本身可能就是疾病遗传机制的候选改变位点。（5）易于进行自动化、规模化分析，缩短了研究时间。由于SNP的二态性，非此即彼，在基因组筛选中SNPs往往只需+/-的分析，而不用分析片段的长度，这就利于发展自动化技术筛选或检测SNPs。检测单核苷酸差异的方法单链构象多态性（SingleStrandConformationPolymorphism，SSCP）

DNA片段双链变性成单链后，在非变性条件下会折叠成不同的空间构象，单链这种构象会因个别核苷酸置换而改变，长度相同或相近的单链在电泳时由于构象不同而具不同迁移率，从而显示出多态性。在SSCP分析时，应先将扩增后的DNA片段变性为单链，然后在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳。检测单核苷酸差异的方法基因芯片法

其基本原理是利用DNA分子的变性杂交特性，通过DNA芯片上的固定探针或样品DNA与游离样品DNA或探针杂交来推断未知靶分子的序列，杂交发生与否可采用荧光标记技术来检测。由于该技术可将大量探针同时固定于支持物上，所以一次可以对大量DNA分子进行检测分析，解决了传统印迹杂交技术复杂、自动化程度低、检测目的分子少、效率低的问题。近年来的实验结果指出，一次实验就可以同时分析成千个多态