2022自然周期体外受精在辅助生殖领域的应用(全文)

2022自然周期体外受精在辅助生殖领域的应用（全文）摘要近年，随着治疗理念的转变和经验的积累，损伤小、更接近生理状态的自然周期体外受精（invitrofertilization，IVF）越来越受到青睐。自然周IVF不仅可以降低治疗成本，还能有效减少患者来院就诊次数，提高治疗的满意度和依从性。卵泡提前破裂等导致的周期取消率高仍是自然周期IVF面临的主要问题。高龄、子宫内膜容受性下降等也是影响妊娠结局的危险因素。虽自然周期IVF并不降低胚胎染色体异常风险，但产科结局仍优于常规IVF。本文从自然周期IVF的定义出发，就其在辅助生殖治疗过程中的关键技术环节、影响妊娠结局的因素分析和子代安全性及围产结局等方面作一综述。【关键词】受精，体外；胚胎移植；妊娠结局；自然周期；改良自然周期1978年，世界首例“试管婴儿”路易斯布朗通过自然周期体外受精（naturalcycleinvitrofertilization，NC-IVF）技术成功妊娠分娩［1］。然而，每周期只取一个卵，一旦失败则意味着全盘皆输。促排卵每周期可获得多个卵细胞和胚胎，明显提高了辅助生殖技术（assistedreproductivetechnology，ART）的成功率，逐渐获得生殖医生的青睐并不断发展、优化成为主流。但是，超生理剂量的雌激素水平不仅明显增加了卵巢过度刺激综合征等促排卵并发症的风险，还会导致着床窗口期移位、子宫内膜容受性下降等进一步影响ART的妊娠结局。随着取卵技术的改进、NC-IVF实施过程中经验的不断积累，不孕夫妇对损伤小、更接近生理状态的NC-IVF兴趣越来越浓厚，北美的一些辅助生殖机构也将NC-IVF列为与常规IVF同等地位的治疗选择［2］。相反，一些学者则对NC-IVF呈保守态度，认为NC-IVF周期取消率高，妊娠结局不如常规IVF。本研究从NC-IVF的定义和内涵出发，就其在助孕治疗过程中的关键技术环节、适合人群选择和影响妊娠成功率的高危因素及围产结局等方面作一综述。一.NC-IVF和改良NC-IVF（modifiedNC-IVF，MN-IVF）的概念2007年国际温和刺激方案辅助生殖技术协会（InternationalSocietyforMildApproachesinAssistedReproduction，ISMAAR）提出，NC-IVF指不应用任何外源性药物，完全依靠女性自身生理周期产生的成熟卵母细胞而进行IVF的一项技术［3］。在临床实践过程中，完全不使用任何药物NC-IVF很难实现。首先优势卵泡排卵的时间不确定，进而导致取卵的时间不定，为增加临床治疗的可操作性，往往给予外源性药物诱发排卵，使取卵时机更有计划性；其次，为降低NC-IVF提前排卵的风险，临床医生常会加用非甾体类抗炎药（non-steroidalanti-inflammatorydrugs，NSAIDs）、克罗米芬（clomifenecitrate，CC）和促性腺激素释放激素拮抗剂（gonadotropin-releasinghormoneantagonists，GnRH-A）等，这种方式本身并不影响卵泡的募集和优势卵泡的发育，也不会促进多卵泡产生，在临床上更常用，更被认可。ISMAAR将使用避免或减少周期取消发生药物的NC-IVF，包括应用人绒毛膜促性腺激素（humanchorionicgonadotropin，hCG）/GnRH激动剂扳机、GnRH-A抑制黄体生成素（luteinizinghormone，LH）峰和联合/不联合反向添加促性腺激素（gonadotropin，Gn）等定义为MN-IVF。2019年欧洲人类生殖与胚胎学学会（EuropeanSocietyofHumanReproductionandEmbryology，ESHRE）的超促排卵指南也将在自然的月经周期中从卵巢收集一个或多个卵母细胞、而仅在阻断自发性LH峰和/或诱导卵母细胞最终成熟阶段使用药物的方案定义为MN-IVF［4］。查阅文献，目前关于NC-IVF或MN-IVF的临床研究也均为类似的情况，罕有不使用任何药物的NC-IVF研究。因此，本综述中所述的NC/MN-IVF泛指在卵泡发育阶段，不使用任何外源性药物促进卵泡生长，允许卵泡在生理性激素的作用下自然生长并形成优势卵泡的ART；其中，既包括仅使用hCG及其类似物、GnRH激动剂等促进卵泡最终成熟、诱发排卵的周期，也包括联合使用GnRH-A等药物抑制提前排卵的周期。二.NC/MN-IVF助孕过程中的关键技术环节卵泡监测：医疗干预少、省时方便是NC/MN-IVF的特色之一，而患者来院进行卵泡监测的次数在其中起着至关重要的作用。以月经周期规律、历时28d的女性为例，首次卵泡监测的时间可以在月经周期的第10~12日之间，其后根据卵泡生长的情况，隔日或每日来院监测，当优势卵泡直径达到16mm、血雌二醇浓度≥700pmo/L时，给予hCG5000U扳机h之后取卵，整个治疗过程中卵泡监测的频率为1.2次/周期，2~3个周期NC/MN-IVF的监测次数与常规IVF相当［5］。而扳机和取卵时机，各辅助生殖机构可以根据自身的经验和特点灵活掌握。既往研究提示，NC/MN-IVF中如优势卵泡直径达18mm之后再扳机，卵泡提前破裂的风险高达47%［6］，且扳机后卵泡还会继续生长1~3mm，因此大部分学者选择当卵泡直径达15~18mm时扳机［7］。扳机的药物可以选择hCG5000~10000U、重组hCG250μg、GnRH激动剂或联合扳机等多种方式。目前尚无扳机时机和药效比较的临床研究和推荐建议。预防卵泡提前破裂的方法：NC/MN-IVF周期，卵泡提前破裂的发生率为15%~71%。卵泡提前破裂导致的周期取消率高是NC/MN-IVF临床应用过程中面临的主要困境之一，在满足卵母细胞成熟的基础上，尽量减少卵泡提前破裂的常用方法有如下几种：（1）GnRH-A：在LH峰出现前给予GnRH-A可抑制提前排卵并将取卵时机推迟1d。因GnRH-A在抑制LH的同时，也干扰内源性卵泡刺激素follicle-stimulatinghormone，FSH）的促卵泡生长作用，故如GnRH-A给药超过一次者，需同时反向添加FSH预防卵泡萎缩［8］，且新鲜周期移植需加用黄体支持。（2）NSAIDs：常用药物为布洛芬和吲哚美辛，NSAIDs可通过降低卵泡液内前列腺素E2和白细胞介素-8等炎症因子的浓度调节排卵前炎症级联反应而抑制卵泡提前破裂［9］。在LH峰出现前后使用可将取卵时间推迟数小时［10］。研究表明在早发LH峰（LH=10~20U/L）出现后给予400mg/次、tid的布洛芬至取卵日，48h后取卵，卵泡提前破裂率与无提前出现LH峰的患者相似［11］，且无明显胃肠道等不良反应，但并不推荐对所有NC/MN-IVF周期常规应用NSAIDs。（3）CC：为雌激素受体拮抗剂，抑制雌激素对下丘脑的正反馈作用，从月经周期的第7日开始预防性应用CC25mg/d至扳机日，可将卵泡提前破裂率低降至6.8%，鲜胚移植率提高至54.4%［5］。应用期间无明显潮热、头疼等不良反应，且无卵巢囊肿形成。取卵手术：卵泡冲洗可明显提高NC/MN-IVF周期的获卵率。单纯卵泡抽吸的获卵率仅为44.5%，第一次冲洗液中的获卵率为20.7%、第二次冲洗液中的为10.4%、第三次的为4.3%，经过3次冲洗，可使总获卵率44.5%提高至80.5%［12］。因此，大多数辅助生殖机构在NC/MN-IVF周期中常规进行卵泡冲洗，根据卵泡大小，每次使用2~5mL培养液，冲1~3次。三.影响NC/MN-IVF妊娠结局的因素和改善方法常规IVF通过促进多卵泡发育形成多个可移植胚胎，形成的胚胎越多，成功妊娠的概率越大；因此，年龄、卵巢储备功能、获卵数、胚胎质量和内膜状态等都是预测常规IVF妊娠结局的重要指标。然而，NC/MN-IVF每周期仅有一枚优势卵泡产生，体内激素水平更接近生理状态，其妊娠结局的预测指标可能有别于常规IVF。1.年龄和卵巢储备功能对NC/MN-IVF的影响：随着年龄的增加，不仅卵细胞的数量减少，质量也明显下降，优势卵泡提前排卵、空卵泡以及受精失败等发生率明显增加。2016年的一项纳入947个NC/MN-IVF周期的回顾性队列研究显示，年龄是影响NC/MN-IVF妊娠结局的唯一独立危险因素，而卵巢储备功能、不孕因素等均对NC/MN-IVF的结局无影响［13］。高龄患者不仅周期取消率（23.8%比17.4%）升高，且每卵妊娠率（15.0%19.7%）和每移植周期妊娠率（23.5%比34.5%）均显著低于年龄35岁以下者［2］，且年龄越大，妊娠结局越差，40岁以上者的每启动周期妊娠率仅为5.9%，而流产率高达50%，持续妊娠率仅为3.0%［13］。抗苗勒管激素（anti-Müllerianhormone，AMH）是由窦卵泡的颗粒细胞分泌的不受月经周期影响的卵巢储备功能标志物，能反映卵巢对促排卵药物的反应性，但其与妊娠结局的相关性仍存在争议。近期的一项meta分析表明，AMH水平与常规IVF周期的着床率和临床妊娠率无关［14］；2019年的一项针对AMH与NC/MN-IVF周期妊娠结局相关性的研究也提示，AMH≤0.5ng/mL者与AMH>2.04ng/mL者的周期取消率、获卵率、生化妊娠、临床妊娠及活产率差异均无统计学意义［15］。因此，高龄是导致NC/MN-IVF周期妊娠率低的危险因素，而AMH等卵巢储备功能标志物对NC/MN-IVF结局的预测作用较小。对卵巢低反应（poorovarianresponse，POR）人群，即使应用大剂量Gn，获卵率仍较低，因此干预少的NC/MN-IVF更受青睐。很多研究已证实了NC/MN-IVF在POR患者中的良好应用效果，尤其是在高龄POR患者中，其治疗效果与常规IVF无差异。2020年意大利的一项单中心回顾性队列研究纳入585例年龄≥40岁且符合博洛尼亚标准诊断的POR患者，比较NC/MN-IVF和常规IVF的治疗效果，结论提示虽然NC/MN-IVF的每启动周期妊娠率仅为6.25%，但每患者的妊娠率可达15.7%，与常规IVF的19.7%差异无统计学意义［16］。NC/MN-IVF对年轻POR患者的治疗效果与卵巢储备功能正常者相似［2］，每启动周期的临床妊娠率为14.5%，每移植周期的临床妊娠率为34.5%［17］。此外，连续3次NC/NM-IVF周期取卵受精、积累胚胎后再移植策略，不仅可有效避免无胚可移植给患者身心带来的巨大压力，还能明显提高临床妊娠率和活产率，尤其是对于35岁以上的患者，累积胚胎后移植的优势更明显［18］。因此，既往接受常规促排卵治疗后获卵数少的POR、尤其是高龄患者，再次助孕时选择NC/MN-IVF可能获得最大收益；而卵巢储备功能正常、年轻的不孕患者，首次IVF助孕时仍建议常规促排卵方案。子宫内膜和胚胎质量：子宫内膜容受性和胚胎质量是妊娠结局的重要影响因素。超声测量子宫内膜厚度是一种简单方便且微创的内膜容受性评估方法，也是预测IVF成功率的指标之一［19］。在常规IVF治疗中，子宫内膜在促排卵药物作用下可能出现着床窗口期移位而导致着床失败，尤其当子宫内膜厚度变薄甚至<7mm时临床妊娠率显著下降，这可能与子宫内膜过薄者基底层明显增加的氧浓度干扰胚胎着床相关［20］。内膜厚度和胚胎质量也同样影响NC/MN-IVF的妊娠结局。2018年vonWolff等［21］回顾性分析了105例接受NC/MN-IVF治疗的患者，研究显示当内膜厚度≤7mm时临床妊娠率仅为7.4%，明显低于内膜>7mm时的30.8%；2020年Tomic等［22］的研究也提示NC/MN-IVF治疗后的妊娠组扳机日子宫内膜的平均厚度为11.4mm，明显厚于非妊娠组的8.6mm。因此，NC/MN-IVF周期中，虽然大剂量促排卵药物导致的着床窗移位的可能性较小，但子宫内膜基底层的氧化应激作用可能是导致内膜过薄患者不良妊娠结局的重要原因。常规促排卵方案中使用的Gn可能通过降低胚胎的卵裂能力进而影响其质量和发育潜能［23］。NC/MN-IVF周期无外源性激素刺激，卵细胞完全在生理性激素作用下发育成熟，所形成的胚胎虽非整倍体率无明显降低，但胚胎质量却优于常规IVF周期［24］。2020年的一项对552个NC/MN-IVF周期产生的卵裂期胚胎的分析研究显示，第3日胚胎的卵裂球数量和碎片率对着床率的预测价值高，而卵裂球的均匀程度和是否存在多核则与着床率无明显相关性［22］。因此NC/MN-IVF的胚胎发育潜能可能更高，不能用常规IVF的胚胎评估体系来评估NC/MN-IVF的胚胎质量。IVF联合未成熟卵体外成熟（invitromaturation，IVM）：自1994年世界首例IVM婴儿诞生至今，已有超过5000例的新生儿出生［25］。IVM的妊娠率低于常规IVF，一度限制了其临床应用；随着“微创”治疗理念的不断深入，不促排卵、卵巢过度刺激综合征发生率极低、治疗费用明显减少的IVM再次受到重视。干预少、接近生理状态也是NC/MN-IVF的主要优势，但每周期仅可获得一枚成熟卵细胞是其面临的主要问题，NC/MN-IVF联合IVM在结合二者“自然、微创”优点的同时，能很好地弥补获卵数少、临床妊娠率低的缺陷。2019年González-Ortega等［26］的研究表明，接受NC/MN-IVF联合IVM治疗的多囊卵巢综合征患者的临床妊娠率（39.0%比53.6%）和活产率（30.5%比42.6%）均与常规IVF差异无统计学意义，且无一例卵巢过度刺激综合征的发生。人卵泡的选择从月经周期的第1~5日开始，随着一个优势卵泡的不断发育，同时募集的其他卵泡中的颗粒细胞发生凋亡和黄素化，在排卵期前后发生闭锁，而其中的卵母细胞也于此时丧失了活性［27］。然而，动物实验表明非优势卵泡闭锁早期的变化和优势卵泡的成熟过程相似，在这一过程中，非优势卵泡中的卵细胞完成了最后的成熟，约20%的闭锁卵泡中的卵细胞是成熟的MII卵。临床研究结果也支持此理论。2016年的一项回顾性研究纳入771例NC/MN-IVF患者，在穿刺取卵过程中，除了抽吸优势卵泡外，还将所有直径在3~10mm间的小卵泡同时穿刺，结果在非优势卵泡中获卵3557枚，是优势卵泡获卵数的7倍，其中MII卵902枚，获得例活产；而298例在优势卵泡中未获卵者，也有87.6%的人从非优势卵泡中成功获得卵细胞，并得到了38例活产，使NC/MN-IVF的活产率提高了36%［28］。虽然小卵泡来源卵细胞的囊胚形成率仅为18%，明显低于优势卵泡的45%，而一旦形成囊胚，其发育潜能完全正常，移植后活产率高达43.8%，与同期常规IVF者相似，且小卵泡来源的新生儿发育异常和染色体异常的比例也与优势卵泡来源新生儿无差异［29］。由此可见，IVF联合IVM是显著提高NC/MN-IVF妊娠结局的有效治疗选择。四.NC/MN-IVF的安全性和产科结局ART的安全性一直是备受关注的热点。早期的动物实验表明，超促排卵过程中高水平的FSH通过增加姐妹染色单体的交换进而导致DNA损伤，使得卵细胞非整倍体率明显升高［30-31］；Vogel等［32］的研究则表明，虽然来自促排卵后卵细胞形成的受精卵染色体异常的比例明显升高，但如果形成囊胚则染色体异常的风险与自然妊娠无差别。与大多数动物实验的结果不同，在人体内，无论是微刺激方案还是常规IVF方案，促排卵均不会导致胚胎非整倍体率增加。Barash等［33］对接受胚胎植入前遗传学检测的4000个人体胚胎进行了单核苷酸多态性分析，显示胚胎非整倍体率与Gn的总剂量无关。2019年的一项纳入3277个IVF周期的前瞻性研究也提示NC-IVF的胚胎非整倍体率与常规IVF相似［7］。因此，虽然NC/MN-IVF的成熟卵细胞是优选出来的，但并不意味着其染色体更正常。ART出生的子代即便是单胎妊娠，早产和低出生体质量儿的发生率也