无菌检查的学习课件

无菌检查的学习课件第1页/共46页无菌检查法第2页/共46页一·基本定义无菌检查是检查要求无菌的药品.医疗器具.原料.辅料.以及要求无菌的其他物品是否染有活菌的一种方法。符合无菌检查法的规定仅表明了供试品在该检验条件下未发现细菌和真菌污染。第3页/共46页二·环境要求环境洁净度10000级和局部洁净度100级一般要求18~26℃45％~65％例行消毒处理洁净度检查第4页/共46页三·仪器及用具无菌室内常备器具恒温培养箱及生化培养箱离心机，显微镜，高压蒸汽灭菌器，恒温烤箱，开放或全封闭过滤系统等玻璃器皿无菌衣，裤，帽，口罩除菌滤器及滤膜第5页/共46页四·培养基一般采用商品脱水培养基洁净玻璃器皿纯水培养基的pH应符合规定分装好的培养基及时密封后必须在配制当天（2小时内最佳）进行灭菌处理培养基的储存第6页/共46页真菌培养基改为改良马丁培养基选择性培养基增加1种

ß-内酰胺酶培养基（用于ß-内酰胺类供试品）即在硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基在接入供试品前分别加入ß-内酰胺酶，ß-内酰胺酶的用量应通过验证试验验证。其他中和剂或分散剂的量亦应通过验证。第7页/共46页培养基的用量培养基的适用性检查

培养基的无菌性检查培养基的灵敏度检查第8页/共46页培养基的灵敏度检查

硫乙12ml，9支，4株菌，各1ml，每种培养基各接种2支（原3支），另1支培养基空白对照。培养3d(原5天)。改良马丁9ml，5支，2株菌，各1ml，每种培养基各接种2支（原3支），另1支培养基空白对照。培养5d。结果判定空白管培养基无菌生长，加菌的培养基管均生长良好，判灵敏度检查合格。（原3支管有2管生长，合格。）

第9页/共46页五·菌种及菌液制备菌种的保藏和传代甘油冷冻管保藏法斜面低温保藏法菌种

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003]铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[CMCC(B)10104]生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)[CMCC(B)64941]白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001]

黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC(F)98003]

第10页/共46页菌液制备一般当日使用金葡·铜绿的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，30～35℃培养18～24h黑曲霉菌接种至改良马丁琼脂斜面培养基中，20～25℃培养5～7d第11页/共46页稀释液、冲洗液及其制备法①0.1%蛋白胨水溶液蛋白胨1g,加水1000ml,加热使溶，过滤，调pH值至7.1±0.2，分装，灭菌。冲洗液用。②pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液

KH2PO43.56g，Na2HPO47.23g，NaCl4.3g,蛋白胨1g,加水1000ml,加热使溶，过滤，分装，灭菌。③聚山梨酯80-0.1%蛋白胨水溶液蛋白胨1g,聚山梨酯10ml，水1000ml,加热使溶，过滤，调pH值至7.1±0.2，分装，灭菌。用于水溶性供试品的无菌检查。④聚山梨酯80氯化钠-蛋白胨缓冲液聚山梨酯8010ml,KH2PO43.56g，Na2HPO47.23g，氯化钠4.3g，蛋白胨1g，水1000ml，加热使溶，过滤，分装，灭菌。用于水溶性供试品的无菌检查第12页/共46页六·方法验证试验检验方法必须验证薄膜过滤法验证试验直接接种法验证试验判断第13页/共46页增订：方法验证试验

当供试品为新的产品或供试品的检验条件发生改变时，应进行方法验证试验，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可以忽略不计。验证时，按“供试品的无菌检查”的规定及下列要求进行操作。对每一试验菌应逐一进行验证。第14页/共46页薄膜过滤法

将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入小于100cfu的试验菌。取出滤膜接种至相应的培养基中，或将培养基加至滤筒内。取一支装有同体积培养基的容器，加入等量的试验菌，作为阳性对照，按规定温度培养3～5天。各试验菌同法操作。第15页/共46页

直接接种法

取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基8支，分别接入金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌的菌悬液1ml(含菌小于100cfu)各两管；取符合直接接种法培养基用量要求的改良马丁培养基4管，分别接入白色念珠菌、黑曲霉菌的菌悬液1ml(含菌小于100cfu)各两管。其中1管接入规定量的供试品，另1管作为阳性对照，按规定的温度培养3～5天。第16页/共46页

与阳性对照比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用，可按此法进行供试品的无菌检查。如含供试品的任一容器中微生物生长微弱、缓慢或不生长，则供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，可采用增加冲洗量；增加培养基的用量；使用中和剂如ß-内酰胺酶、对氨基苯甲酸、聚山梨脂80等；更换滤膜品种等方法，消除供试品的抑菌作用，并重新进行验证试验。验证试验可与供试品的无菌检查同时进行。第17页/共46页供试品抽验量和检验量

检验数量指一次试验所用的供试品最小包装容器的数量。

检验量指一次试验所用的供试品总量（g或ml）。每份培养基接种的供试品量。

抽验量生产厂和药检所的检验数量和检验量与2000版的规定基本一致，见表1、表2、表3。其中表3是增订固体制剂的最小检验量。个别做了修订。第18页/共46页

表1批产品出厂最少检验数量供试品批产量N（个）每种培养基最少检验数量注射剂

≤10010%或4个（取较多者）

100＜N≤50010个

＞5002%或20个（取较少者）大体积注射剂（＞100

ml）

2%或10个（取较少者）眼用及其他非注射产品

≤2005%或2个（取较多者）

＞20010个桶装固体原料

≤4每个容器

4＜N≤5020%或4个容器（取较大者）

＞502%或10个容器（取较大者）第19页/共46页抗生素固体原料药（≥5克）

6瓶(支)医疗器具

≤10020%或4件（取较大者）

100＜N≤50010件

＞5002%或20件（取较少者）

注：1.每种培养基各接种10支供试品。2.抗生素粉针剂（≥5克）及抗生素原料药（≥5克）的最少检验数量为6瓶（或支），桶装固体原料的最少检验数量为4个包装。3.如果医用器械体积过大，培养基用量可在2000ml以上，将其完全浸没。

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表2.上市抽验样品（液体制剂）的最少检验量供试品装量V(ml)每支样品接入每管培养基的最少量（ml）最少检验数量（瓶或支）≤1全量2011＜V＜5半量105≤V＜2021020≤V＜5051050≤V＜100101050≤V＜100(静脉给药)半量10100≤V＜500半量6V≥50050061.每种培养基各接种10支供试品。

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表3上市抽验样品（固体制剂）的最少检验量供试品装量M（mg/支或瓶）每支样品接入每管培养基的最小量（mg）最少检验数量（瓶或支）M<50全量20（1）50≤M<300半量10300≤M<5g15010M≥5g500102外科用敷料棉花及纱布取100mg或1cm×3cm10缝合线、一次性医用材料整个材料310带导管的一次性医疗器具（如输液袋）

10其它医疗器具整个器具3（切碎或拆散开）10第22页/共46页注：1.每种培养基各接种10支供试品。2.抗生素粉针剂（≥5克）及抗生素原料药（≥5克）的最少检验数量为6瓶（或支），桶装固体原料的最少检验数量为4个包装。3.如果医用器械体积过大，培养基用量可在2000ml以上，将其完全浸没。第23页/共46页修订①大容量（50-100ml注射剂），取半量检查。②表1，2，3中最少检验量不包括阳性对照试验的用量。薄膜过滤法增加1/2的最小检验数量作阳性对照用；直接接种法增加供试品1支作阳性对照。③采用直接接种法，若每支（瓶）供试品的装量按规定足够接种两份培养基时，则应接种硫乙和马丁培养基。采用薄膜过滤法，其检验量不少于直接接种法的总量，只要供试品特性允许，可将容器内容物全部过滤。第24页/共46页阳性对照

应根据供试品的特性选择相应的阳性对照菌：无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌；抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌；抗厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为对照菌；抗真菌的供试品，以白色念珠菌为对照菌。第25页/共46页阳性对照试验的菌液制备

同培养基灵敏度检查（大肠埃希菌的菌液制备同培养基的灵敏度检查中的金黄色葡萄球菌），如菌量为小于100cfu，供试品用量同供试品无菌检查每份培养基接种的样品量（见表2、表3）。阳性对照管培养48~72小时应生长良好。第26页/共46页阴性对照

每次无菌检查所用的溶剂、稀释剂和冲洗剂同法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。第27页/共46页检查法有直接接种法和薄膜过滤法。增订：只要供试品允许，可优先采用薄膜过滤法。如果容器内有一定的真空度，可用带有除菌过滤器的针头，向检品容器内导入无菌空气。各供试品检查时，所用培养基的装量必须以“验证试验”的结果而定。第28页/共46页1）薄膜过滤法修订：设备及注意事项单列一段。又强调了要“优先采用封闭式薄膜过滤器，也可用一般薄膜过滤器。”无菌检查用的滤膜孔径为0.45µm与直径为50mm。第29页/共46页

根据供试品及溶剂的特性选择滤膜的材质。如抑菌性供试品采用具有疏水性边缘及低吸附性的滤膜。滤器及滤膜采用适宜的方法灭菌；使用时，要保证滤膜的完整性；水溶性供试品，先用少量冲洗液湿润滤膜。油类供试品，滤膜和滤器，在使用前应充分干燥，备用。过滤时，保持供试液及冲洗液覆盖整个滤膜表面；冲洗滤膜时，每张滤膜每次冲洗量为100ml，冲洗液、冲洗量及冲洗方法与方法验证相同。第30页/共46页供试品的处理供试品分8类，增订5种：③④⑤⑥⑦。①水溶性供试品取规定量，直接过滤，或加稀释剂，混匀后，过滤。有抗菌作用或有防腐剂的供试品，冲洗滤膜不得少于3次。接种培养基封闭式过滤器（二支过滤器或以上），100ml/支一般过滤器（一支过滤器），取出滤膜，分成3份，50ml/管第31页/共46页②固体制剂无菌粉针剂或无菌粉末原料的供试品。取规定量，加适宜的溶剂溶解或按标签说明复溶，根据其溶解性按水溶液或非水溶性供试品项下的方法检验。第32页/共46页③β-内酰胺类抗生素供试品取规定量，按水溶性制剂或无菌粉针剂及无菌粉末原料的供试品处理法处理，薄膜过滤，用冲洗液冲洗数次。最后一次用适量的β-内酰胺酶冲洗液清除残留在滤筒、滤膜上的抗生素后接种培养基；或将滤膜直接接入含适量β-内酰胺酶的培养基。④非水溶性的供试品取规定量，直接进行过滤或溶于含适量的聚山梨酯80或其它适宜溶剂的稀释剂中，立即过滤，用聚山梨酯80-0.1%蛋白胨溶液冲洗滤膜数次，于聚山梨酯80培养基中培养。第33页/共46页④非水溶性的供试品

取规定量，直接进行过滤或溶于含适量的聚山梨酯80或其它适宜溶剂的稀释剂中，立即过滤，用聚山梨酯80-0.1%蛋白胨溶液冲洗滤膜数次，于聚山梨酯80培养基中培养。第34页/共46页⑤可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和黏性油剂供试品取规定量，混合至适量无菌十四烷酸异丙酯中，迅速振摇，使供试品充分溶解（稀释），必要时，供试品可适当加热，温度不超过44℃，趁热迅速过滤。十四烷酸异丙酯的用量同方法验证试验；无菌十四烷酸异丙酯，将购买的十四烷酸异丙酯用0.22µm脂溶性滤膜过滤即得，该滤膜140℃干热灭菌2h。

若无法过滤，接着加不少于100ml的稀释液，充分震摇萃取，静置，以下层水相作供试液，过滤，以适量冲洗液冲洗滤膜数次，于聚山梨酯80培养基培养。第35页/共46页⑥无菌气（喷）雾剂供试品

取规定量，将样品容器置冰室冷冻约1小时。速以无菌手续在容器上钻一小孔，释放推进剂后再无菌开启容器，分别用无菌稀释液稀释并转移至一无菌容器中，加稀释液至100ml，按水溶性制剂或非水溶性制剂项下方法检验。第36页/共46页⑦装有药物的注射器

取规定量，装上无菌针头（非包装中所配带的），吸入稀释液或标签所示的溶剂溶解，按水溶性制剂或非水溶性制剂项下方法操作。同时应做包装中所配带的无菌针头的无菌检查。第37页/共46页⑧具有导管的医疗器具（输血、输液袋等）

取规定量，用冲洗液50ml/袋分别冲洗内壁，集中冲洗液于适宜的无菌容器中，薄膜过滤。同时应做包装中所配带的针头的无菌检查。第38页/共46页2）直接接种法供试品的处理和接种2000版有6类（液体，固体，外科敷料-棉、纱布、肠线，灭菌医用器具，青霉素，放射药品）。2005版有9类供试品，其中增订3种-非澄清水溶液供试品；非水溶性供试品。β-内酰胺类供试品。直接接种法即每支（或瓶）供试品按规定量分别接入含培养细菌及真菌培养基的容器中。除另有规定外，每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的10%(表2)，用量和培养基的高度同方法验证试验；每种培养基接种的管数同供试品的检验数量。第39页/共46页9种供试品的处理和接种①一般水溶性供试品②混悬液等非澄清水溶液供试品取规定量接种至培养基中。③固体制剂供试品取规定量直接接种，或加入适宜的溶剂溶解，或按标签说明复溶后，取规定量接种至培养基中。④ß-内酰胺类或磺胺类供试品取规定量，混合，加入适量的无菌ß-内酰胺酶溶液或对氨基苯甲酸溶液使中和，接种至培养基中。或接入含ß-内酰胺酶或对氨基苯甲酸的培养基中。第40页/共46页⑤非水溶性供试品取规定量，混合，加入适量的聚山梨酯80或其它适宜的乳化剂及稀释剂使其乳化，接种至培养基中。或直接接种至含聚山梨酯80或其它适宜乳化剂的培养基中。⑥敷料供试品取规定数量，以无菌操作拆开包装，于不同部位分别剪取约100mg或1cm×3cm的供试品，接种于