硫化氢(H2S)含量的测定

实验六硫化氢（H2S）含量的测定

（第六组：杨如春、农春响、李太蓉、陈登卫、何再炳）I二六硝基苯甲酸法

1.实验原理

硫化氢（H2S）目前被认为是植物中一种新的信号分子，参与植物细胞的氧化还原平衡等多种生理过程。H2S易溶于水，1molH2S与1mol二六硝基苯甲酸（DT-NB）反应后，形成2mol黄色产物——硫硝基苯甲酸，此物质在412nm处有最高吸收峰，并且在此波长处的毫摩尔吸光系数为£412=27.2Lmmol-1.cm-1，因此可根据硫硝基苯甲酸生成的量来计算植物组织中H2S的含量。实验中常用的H2S供体有NaHS、Na2S、GYY4137等，它们溶于水后可释放出H2S，H2S在水中溶液中常解离为H+、HS-、S2-。

2.材料、仪器设备及试剂

(1)材料取热激0h、热激4h并恢复4h和高温胁迫17h的玉米幼苗。(2)仪器设备紫外可见分光光度器，高速冷冻离心机，微量加样器，分析天平，水浴锅，研钵，量筒，吸量管，刻度试管，试管架，容量瓶，药勺。(3)试剂H2S提取液(100mmol/L磷酸钾缓冲溶液(ph7.4)，内含10mmol/LEDTA和0.25%醋酸锌)；50mmol/LFeCl3(用1.2mol/LHCl配置)；5mmol/LN,N-二甲基对苯二胺(用7.2mol/LHCl配置)；10μmol/LNa2S。

3.实验步骤(1)H2S的提取热激0h(热激前)黄化玉米幼苗热激4h并恢复4h黄化玉米幼苗48℃高温胁迫17h黄化玉米幼苗0.5g0.5g0.5g加预冷的提取液1mL和少许石英砂，充分冰浴研磨转入离心管离心15min(4℃下12000×g),取上清液

(2)H2S的测定取200µL上清液加入提取液3760µL，摇匀再加40µL20mmol/LDTNB,摇匀2min于412nm处测定吸光度A412

(3)标准曲线的制作10μmol/LNaHS（mL）0246810蒸馏水(mL)1086420各取1mL于6支试管中分别去200µL，加入提取液3760µL，摇匀再加入40µL20mmol/LDTNB，再摇匀2min于412nm处测定吸光度A412以NaHS浓度为横坐标，A412为纵坐标，建立标准曲线或回归方程

4.结果计算

从标准曲线中查找出相应的H2S浓度，用µmol/g表示H2S含量。

H2S含量（µmol/g）=C/w×(Vt/1000)式中：C为标准曲线上查出的H2S浓度；

Vt为提取液的总体积，即1mL；

W为材料的鲜重（g）。

5.实验注意事项

(1)离心后上清液应定容到一个准确的体积，以便于含量计算。(2)实验中，应严格控制DTNB的用量。Ⅱ亚甲蓝法

1.实验原理在FeCl3(作为氧化剂)存在的强酸性条件下，硫化氢(H2S)与N,N-二甲基对苯二胺反应生成蓝色的亚甲蓝，亚甲蓝在667nm处有最大吸收,故可根据亚甲蓝生成的量来计算植物组织中H2S的含量。此法专一性和灵敏性好，检测极限低于5μmol/L,理想条件下可达到10nmol/L。

2.材料、仪器设备及试剂

(1)材料取热激0h、热激4h并恢复4h和高温胁迫17h的玉米幼苗。(2)仪器设备紫外可见分光光度器，高速冷冻离心机，微量加样器，分析天平，水浴锅，研钵，量筒，吸量管，刻度试管，试管架，容量瓶，药勺。(3)试剂H2S提取液(100mmol/L磷酸钾缓冲溶液(ph7.4)，内含10mmol/LEDTA和0.25%醋酸锌)；50mmol/LFeCl3(用1.2mol/LHCl配置)；5mmol/LN,N-二甲基对苯二胺(用7.2mol/LHCl配置)；10μmol/LNa2S。

3.实验步骤(1)H2S的提取热激0h(热激前)黄化玉米幼苗热激4h并恢复4h黄化玉米幼苗48℃高温胁迫17h黄化玉米幼苗1g1g1g加预冷的提取液3mL和少许石英砂，充分冰浴研磨转入离心管离心15min(4℃下12000×g),取上清液

(2)H2S的测定热激0h(热激前)黄化玉米幼苗上清液热激4h并恢复4h黄化玉米幼苗上清液48℃高温胁迫17h黄化玉米幼苗上清液2.4mL2.4mL2.4mL加入0.3mL5mmol/LN,N-二甲基对苯二胺，摇匀加入0.3mL50mmol/LFeCl3，摇匀15min于667nm处测定吸光度A667

(3)标准曲线的制作10μmol/LNa2S（mL）0246810蒸馏水(mL)1086420各取2.4mL于6支试管中加入0.3mL5mmol/LN,N-二甲基对苯二胺，摇匀加入0.3mL50mmol/LFeCl3，摇匀15min于667nm处测定吸光度A667以Na2S浓度为横坐标，A667为纵坐标，建立标准曲线或回归方程

4.结果计算

从标准曲线中查出相应的H2S浓度，求H2S的含量(μmol/g)。公式如下：H2S的含量(μmol/g)=(C/ω)