高效液相色谱法测定竹柏叶穗花双黄酮含量

高效液相色谱法测定竹柏叶穗花双黄酮含量

竹柏树专生（thun.）oll等人，是罗汉松科植物。广泛分布于广东、浙江、福建、广西等地。竹柏在我国南方有大量栽培,但多作为观赏的庭园、园林树种,在医药上的研究应用并不多见。竹柏具有止血、接骨、消肿、抗肿瘤作用,其主要含黄酮、萜类、挥发油等成分;但在黄酮类成分方面的研究仍较为鲜见,特别是含量测定方面,故作者对竹柏叶中的黄酮类成分进行了研究,建立了穗花双黄酮的高效液相色谱含量测定方法,为竹柏叶中黄酮类成分的开发应用提供依据和基础。药物、药品和相对生物Agilcnt1100型高效液相色谱仪(四元泵、DAD阵列检测器,美国惠普公司);BS124S电子分析天平(德国Sartorius);BP211电子分析天平(德国Sartorius);超声清洗器(北京医疗设备二厂)。穗花双黄酮对照品由广东省中医研究所提供,面积归一法测纯度为99.8%;竹柏叶由广东省广州市中药研究所提供,原植物经蔡岳文副主任中药师鉴定为罗汉松科竹柏Podocarpusnagi(Thun.)ZolletMor。乙腈为色谱纯,其他试剂均为分析纯,水为三蒸水。方法和结果1理论塔板数测定色谱柱为AgilentHypersilC18柱(150mm×4.6mm,5μm);流动相为乙腈-0.05%磷酸水液,梯度洗脱(时间0～30min,乙腈15%～100%);检测波长为340nm;流速为1.0mL·min-1;柱温为20℃。理论塔板数按穗花杉双黄酮计应≥5000。结果见图1。2对照溶液的制备精密称取穗花杉双黄酮对照品,加甲醇溶解制成0.013mg·mL-1的对照品溶液。3供试品溶液制备分别取药材样品,粉碎,取0.33g,精密称定,加50%乙醇10mL,置具塞量瓶中,密塞,称定重量,超声处理40min,取出,放冷,称定重量,补足损失的重量,摇匀,滤过,取续滤液作为供试品溶液。4标准曲线的绘制分别精密吸取对照品溶液1,2,5,8,10μL进行色谱测定,按上述色谱条件测定峰面积,以进样量为横坐标(X,μg)、峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归,得标准曲线。结果显示,进样量在0.013～0.130μg范围呈线性关系,回归方程为y=3273.1x+1.2429,相关系数r=0.9999。5精密度与准确度精密吸取样品溶液10μL,按上述色谱条件,重复测定6次,测得峰面积的积分值,计算精密度,结果穗花杉双黄酮平均峰面积为434.3,RSD为0.29%。6穗花杉双黄酮及穗花杉双黄酮峰面积、rsd取同一供试品溶液10μL按上述色谱条件测定0,0.5,2.5,5,20h,测得峰面积并计算含量,穗花杉双黄酮平均峰面积为442.8,RSD为3.1%,结果显示20h内稳定。7穗花杉双黄酮含量测定结果按拟定的含量测定方法,对同一批样品制备供试品溶液,平行做6份,测得峰面积并计算含量,结果穗花杉双黄酮平均含量为0.317mg·g-1,RSD为2.9%。8加样回收率试验精密吸取已知含量(0.3169mg·g-1)的同一批样品0.17g,分别精密加入1mL的穗花杉双黄酮对照品溶液(0.050mg·mL-1),按供试品溶液制备项下操作,平行操作6份,按拟定色谱条件测定含量,计算回收率,结果见表1。9样品测定分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL,按上述色谱条件测定峰面积,外标法计算各样品中穗花杉双黄酮的含量,结果见表2。样品的制备和提取竹柏具有止血、接骨、消肿作用,用于骨折、外伤出血、风湿痹痛等,还有抗污染、抗肿瘤作用,主要含挥发油、萜类成分和黄酮类成分,其中竹柏内酯A和竹柏内酯B具有极强的细胞毒性作用。由于竹柏中黄酮类成分的研究较少,故作者对其总黄酮进行了提取,并采用高效液相进行了分离分析,结果表明,竹柏叶中黄酮类成分以双黄酮类成分为主,其吸收波长大多均在280和340nm处。故选择在波长340nm处进行分离分析,其中以穗花双黄酮成分的吸收峰较高,可见黄酮类成分中以其含量较高,且有关文献报道穗花双黄酮对磷脂酶C有抑制作用(磷脂酶C是磷酸肌醇转换退速酶,在一些肿瘤中磷酸肌醇的转换活性都有所增强),而磷酸肌醇抑制剂是研究细胞内信息传递和治疗肿瘤的有效工具。因此,本研究选择对穗花双黄酮成分进行了含量测定,为进一步开发总黄酮成分提供研究基础。含量测定结果表明,5批竹柏叶中穗花双黄酮含量为0.246～0.572mg·g-1。在供试品溶液制备方面,还对甲醇、50%乙醇、水进行了比较研究,结果表明甲醇能够将竹柏总黄酮提取出来,但叶绿素也同样被充分提取出来,50%乙醇提取同样能将大部分总黄酮提取出来,而叶绿素被提取出来较少;水则难以提取到总黄酮成分;还对不同浓度(30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%)乙醇进行了提取研究,结果表明,以50%乙醇提取总黄酮类成分较为理想,有利于色谱的分析;考察了提取时间,在超声处理40min时穗花双黄酮加样回收率达到了96.34%。故选择以50%乙醇超声处理40min进行了含量测定。在测定穗花杉双黄酮含量时,参考文献的方法,虽然对照品出峰时间短,但样品的分离不好,个别样品在穗花杉双黄酮保留时间处有吸收峰干扰;采用了文献的方法,但由于使用缓冲盐,