DB15T+2835-2022马驽巴贝斯虫检测 PCR法

ICS65.020.30CCSICS65.020.30CCSB41内蒙古自治区地方标准DB15/T2835—2022PCRPCRmethodfordetectionofbabesiosiscaballi2022-12-082022-12-082023-01-08内蒙古自治区市场监督管理局发布前 言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由中华人民共和国呼和浩特海关提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国二连海关、内蒙古自治区市场监督管理评审查验中心。本文件主要起草人：陈少博、杨帆、王伊琴、常鸿、包勇敢、荆文魁、腾克、赵治国。马驽巴贝斯虫检测PCR法范围本文件规定了马驽巴贝斯虫PCR法和实时荧光PCR检测方法。本文件适用于马属动物马驽巴贝斯虫病的分子生物学诊断。（GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测下列术语和定义适用于本文件。下列术语和定义适用于本文件。马驽巴贝斯虫babesiosiscaballi聚合酶链式反应polymerasechainreaction；PCRDNA（deoxyribonucleicacidDNA经过DNADNA两条链上的一段互补序列发生退火，接着在DNA聚合酶的催化下以4种dNTP（deoxyribonucleoside）DNA25～30106。实时荧光PCRreal-timePCR在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。Ct值cyclethreshold每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。缩略语下列缩略语适用于本文件。bp:碱基对(basepair)CTAB：十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrithylammoniumbromide)DNA:脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）EDTA：乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid)FAM:6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein)PCR:（polymerasechainreaction）TAMRA:(carboxy-tetramethyl-rhodamine)Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane]GB/T6682DNACTAB。。。K20。。K20mg/mL)TaqdNTP（2.5mmol/L）PCRbuffer。DNA（DNAMarker）（50bp～500bp）PCRDNAB。DNA。。表1马驽巴贝斯虫检测引物及探针检测方法引物/探针序列（5’-3’）扩增片段PCR法上游引物（F）5′-CTCTCCAAAGTCTTAAGTAC-3′200bp下游引物（R）5′-CAGCAGATTGAAGACTAAG-3′实时荧光PCR法上游引物（F）5′-CTCTCCAAAGTCTTAAGTAC-3′200bp下游引物（R）5′-CAGCAGATTGAAGACTAAG-3′探针（P）5′-（FAM）-TGAGGCTAAGTACCAACCGCTG-（TAMRA）-3′PCR（12000rpm）（12000rpm）（3000rpm）天平0.01g）。单孔道微量移液器：0.5L～10L、10L～100L、20L～200L、100L～1000L。7样品采集使用添加EDTA抗凝剂的采样管无菌采集血样。8检测方法PCR法DNAADNADNA，DNADNAA260/A2801.7～1.9PCRPCR反应体系为50L，体系组成见表2。表2PCR试剂名称贮备液浓度反应体系体积L10×Buffer(含Mg2+)－5Taq酶5U/L0.25dNTP2.5mmol/L5上游引物（F）10mol/L2下游引物（R）10mol/L2模板－2ddH2O－补足至50检测过程分别设阴性对照、阳性对照和空白提取对照。PCR预变性：95℃，3min；变性：95℃，30s；延伸退火：58℃，1min，35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。PCR用TBE电泳缓冲液配制成1.5%琼脂凝胶。将琼脂凝胶放入电泳槽中，加入1×TBE电泳缓冲液，使液用TBE电泳缓冲液配制成1.5%琼脂凝胶。将琼脂凝胶放入电泳槽中，加入1×TBE电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。将5L～8LPCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合点样。9V/cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部。利用凝胶成像系统观察电泳结果并记录。质控对照应满足以下条件，否则应重新实验：200bp200bp200bp200bp200bpPCRPCR实时荧光PCR检测DNA同7.1.1操作。PCR反应体系体积为25L，见表3。表3荧光定量PCR扩增反应体系组成试剂名称贮备液浓度mol/L反应体系体积LPCR反应预混合液—12.5上游引物（F）101下游引物（R）101探针（P）101模板—2ddH2O—补足至总体积为25检测过程分别设阴性对照、阳性对照和空白提取对照。预变性：95℃，3min；变性：95℃，15s；延伸退火：58℃，1min，40个循环。在58℃时收集荧光信号值。质控对照应满足以下条件，否则应重新实验：Ct40.0；Ct40.0；Ct35.0。，2Ct40.0，2Ct35.01Ct35.0～40.0DNAPCRCtCt40.09防止交叉污染措施检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403中的规定执行。附录A（资料性）溶液配制及提取方法CTAB将5gCTAB，20.45gNaCl，3.03gTris，1.86gNa2-EDTA溶于200mL水中，用盐酸调pH8.0后，定容至250mL，115℃高压15min。CTAB称0.2gCTAB,0.234gNaCl，定容至100mL，115℃高压15min。1.2mol/LNaCl称取28gNaCl，定容至400mL，115℃高压15min。DNA4000rpm/min～5000r/min离心10min。1m）EP2m管0301200rm10min。600L～6504000rpm/min～5000r/min离心10min。1m）EP2m管0301200rm10min。600L～650LEP2CTAB1min。12000rpm离心10min350的1.2mol/LNaCl（2350L溶液。加入350L30min12000rpm10min。EP0.20min，12000rpm离心10min500L7512000rpm10min。，6015s～20s（。100LTEbuffer或DEPC附录B（规范性）马驽巴贝斯虫的目标扩增序列CTCTCCAAAGTCTTAAGTACCCTCTTGAGGCTAAGTACCA