重复经颅磁刺激对脊髓损伤大鼠脊髓兴奋斗性的影响

重复经颅磁刺激对脊髓损伤大鼠脊髓兴奋斗性的影响

自1985年以来，该方法已广泛用于评估人类大脑的髓磁干燥功能。近年来,经颅磁刺激在抑郁症、帕金森病、癫痫、神经性疼痛、脑卒中等神经性疾病的神经可塑性、神经再生等方面显示出很大的临床应用前景。磁刺激大脑皮质区在肢体记录的复合肌肉动作电位主要源于大脑皮质发出的动作电位经下行传导束在脊髓中的传导,这就使重复经颅磁刺激可能通过此途径对脊髓产生生物学效应。既往研究也表明,磁刺激具有调节神经细胞兴奋性、调控神经递质分泌、诱导突触生长等生物学效应。本研究旨在探索重复经颅磁刺激在慢性截瘫大鼠模型中对脊髓节段兴奋性的作用。1正常组和髓胞损伤磁刺激大鼠治疗前后血清因子水平1.2脊髓损伤模型制作实验动物以2%异戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉。麻醉成功后,大鼠俯卧,四肢固定于手术平板上,常规备皮消毒铺单,以T10棘突为中点纵行切口,逐层切开皮肤、皮下筋膜,自动牵开器牵开,显微镜下沿棘突向两侧分离椎旁软组织至关节突外缘,暴露T10棘突、椎板及上下关节突。游离T10椎板上下缘、双侧下关节突,剪断双侧椎弓根椎板结合部后完整游离椎板,暴露硬膜。安置重物打击器(美国NYU打击器),以80g·cm势能打击脊髓,大鼠出现一过性后肢及尾巴摆动。打击成功后彻底止血,逐层关闭肌肉筋膜层、浅筋膜层及皮肤。切口消毒后将大鼠置保温箱内24h,后转入单笼饲养,室温25℃。2周内每8h人工排尿1次,以后每12h1次至建立反射性排尿为止。所有大鼠术后均予庆大霉素20000U,每12h肌肉注射1次预防泌尿系感染。饲养8周后随机分为脊髓损伤组和脊髓损伤磁刺激组。1.3F波检测正常对照组6只、造模后8周及12周脊髓损伤组和脊髓损伤磁刺激组各6只以氯胺酮30mg/kg前肢肌肉注射麻醉后,固定平板上,置于诱发电位仪屏蔽室内(国产ZEP500诱发电位仪)。刺激电极置于腘绳肌内,参考电极置于远端旁开1cm处皮内;记录电极置于腓肠肌内,参考电极置于远端1cm处跟腱内,接地电极紧贴生理盐水浸湿的尾部。刺激频率1Hz,刺激强度从1mA递增,在出现最大波幅时再给以该刺激强度120%的超强刺激,记录10次波形,取其波幅平均值分别记录M波及F波。灵敏度5mV/DIV,脉宽0.2ms。1.4重复经颅磁刺激BEMS-1型磁刺激仪由中国科学研究院电工研究所提供。脊髓损伤磁刺激组大鼠清醒状态下置于固定器中。蝶形线圈磁场中心置于大鼠前囟上方,每日定时行阈上强度刺激,频率0.5Hz,每天500个脉冲,连续刺激4周。脊髓损伤组同法置于固定器中,不予磁刺激。1.5取材与处理正常对照组大鼠及造模后大鼠随机取12只于造模后8周,脊髓损伤组及脊髓损伤磁刺激组大鼠于造模后12周用2%异戊巴比妥钠深度麻醉后,用4%多聚甲醛0.1MPBS(pH=7.4)灌注液固定,灌注后即刻完整取出脊髓。于30%蔗糖灌注液保存,4℃冰箱中过夜。待标本沉降后切取脊髓损伤段,正常对照组取T10棘突水平恒冷切片,行HE、髓鞘常规染色及5-HT免疫组化染色。1.5.1常规HE和髓鞘染色恒冷箱连续纵行冠状切片,片厚16μm,冷贴片,每个脊髓标本裱为4套,每张玻片上的脊髓切片相隔64μm,取第1与第3套切片行HE染色,第2与第4套切片行髓鞘染色,观察损伤部位情况及损伤区病理结构与变化。1.5.2免疫组织化学染色恒冷箱连续脊髓横贯水平切片,片厚40μm,损伤头、尾侧分别切取完整灰质片,按SP法进行5-HT免疫组织化学反应。切片经过抗原修复及消除内源性过氧化物酶的活性后,于单克隆兔抗5-HT抗体(1∶200稀释,Sigma公司)0.4%Triton-X100/0.01MPBS溶液中,4℃冰箱孵育24h;入生物素化二抗(1∶200稀释,SP试剂盒,北京中杉金桥生物技术有限公司)于37℃恒温箱孵育2h;以上每一步骤之后均用0.4%Triton-X100/0.01MPBS浸洗3次,每次5min。入抗生物素FITC(1∶200稀释,北京中杉金桥生物技术有限公司)室温避光显色约30min后反复蒸馏水冲洗,0.01MPBS液中裱片,自然干燥后切片上行脱水、透明、封固。1.6图像处理与统计学方法采用LEICAQWin图象处理与分析系统进行图像分析。实验数据采用SPSS11.5软件进行方差分析,P<0.01为有显著性差异。2结果2.1造模前后f波幅比值的变化每只大鼠所记录M、F波幅在双后肢无差异,取其平均值,计算F/M波幅比值。造模后8周F波幅增高,F/M比值明显高于正常对照组(P<0.01)。12周后脊髓损伤磁刺激组F波幅降低,脊髓损伤组变化无差异,两组F/M比值有显著性差异(P<0.01)。见表1。2.2神经根治的曲大体观察:脊髓硬脊膜完整,损伤节段处脊髓表面淡黄染,血管迂曲,脊髓变得狭窄,神经根完整连续。镜下见打击区空洞形成,内壁光滑,部分呈噬洞样改变,周围环绕密集胶质纤维,横断面空洞外围未见灰质成分,腹侧及外侧索可见少量白质纤维束结构残留。2.35髓损伤组血清5-ht内纤维密度的比较标记物广泛分布于脊髓灰质,高倍镜下主要集中分布于突触末梢、突触间隙、胞体周围。与正常对照组比较,脊髓损伤组头尾两端5-HT能纤维密度明显减少(P<0.01),且尾端减少更甚于头端(P<0.01)。脊髓损伤磁刺激组头尾两端5-HT染色密度与脊髓损伤组比较明显增加(P<0.01)。见表2。3重复经颅磁刺激对髓胞体兴震性的影响磁场可以通过身体任何结构而几乎没有衰减,具有高阻抗的颅骨不会影响磁场的强度,亦不会影响脑组织中感应电流的强度。皮肤、脂肪、骨质、脑膜阻抗高磁场感应产生低电压电流,几乎不兴奋疼痛感受器。经颅磁刺激是一种无电极非侵入性的刺激形式,磁刺激时,电容对线圈放电产生脉冲电流,线圈产生瞬变磁场并作用于组织,磁场脉冲在组织内诱发出的感应电流可以诱导神经细胞膜电位改变,起到兴奋或抑制神经元电活动的作用。近年研究显示,磁刺激可以减轻脊髓继发性损伤、促进运动功能恢复、改善截瘫后括约肌功能。脊髓内下行的传导束无不源于脑内的神经元胞体。神经元是一种分泌细胞,分泌部位通常位于轴突的终末端;胞体内具有高速合成蛋白质的结构,而核糖体却几乎不存在于轴突和神经末梢内,维持轴突生长和功能所需的蛋白、神经递质及神经生长因子等只能由胞体的粗面内质网和高尔基复合体内合成,然后通过轴浆流动,运输到神经的轴突终末。神经突触传递是一个电-化学-电的过程,即由突触前神经元的生物电变化,通过突触末梢的化学物质释放,最终引起突触后神经元的生物电改变。脊髓损伤慢性期,皮质脊髓束胞体所在的大脑皮质运动区兴奋阈值降低,本研究中采用的磁刺激强度足以诱发正常大鼠在后肢记录到复合肌肉动作电位。研究结果表明,重复经颅磁刺激在脊髓损伤区产生了生物学效应。F波由Magladery和McDougal在1950年命名。它是在外周神经施予超强刺激时于M波之后记录到的晚电位,它是运动神经元逆向兴奋的回返放电,是运动神经逆行性传导使脊髓前角细胞兴奋,又经运动神经纤维传导至相应的肌肉而产生的,因此,F波可以反映脊髓前角运动细胞兴奋性。F波通常在脊髓兴奋性低下时出现抑制,在脊髓兴奋性增强时,F波的出现率增高,而且通常呈高波幅。近年来,对于脊髓运动模式发生器的研究发现,脊髓上位运动中枢的损伤将丧失对脊髓节段兴奋性的抑制调控作用,而表现为脊髓反射亢进和肢体痉挛状态。可以认为,F波是脊髓运动神经元突触后电位的反映,对F波的检测已经被作为衡量脊髓运动神经元兴奋性的一种手段。本研究中,脊髓损伤8周后,后肢F波波幅显著增高,与文献报道一致。多数大鼠在损伤平面以下受刺激时频繁出现快速节律性的双后肢剧烈屈伸及摇尾动作,表明脊髓损伤后损伤平面以下脊髓运动兴奋性增加。本研究在处理数据时采用F波幅与M波幅比值进行比较,旨在尽量避免F波检测时个体间受刺激神经束数量的差异造成的误差。实验组在经重复磁刺激后,F波幅与M波幅比值显著降低,并处于稳定状态,后肢异常运动亦有减轻,表明重复经颅磁刺激降低了脊髓兴奋性。据文献报道,投射到大鼠脊髓的5-HT能纤维胞体大部分来自于延髓的中缝核群,其轴突下行广泛分布脊髓灰质,在脊髓后角主要以非突触性连接量子释放形式,而在前角以经典的突触连接形式为主。5-HT广泛参与脊髓内单突触、多突触反射,5-HT能纤维可以下调来自后根的初级感觉纤维兴奋性。5-HT能够通过增加神经元外钾离子浓度降低NMDA诱发的大鼠节律性运动的频率。在调控脊髓兴奋性方面起着重要作用。本研究中,脊髓损伤后损伤头尾端5-HT免疫组化染色密度值均明显低于正常对照组水平。头端5-HT密度的降低可能由于逆行退变所致,尾端仍有少量残留表明脊髓损伤了大部分下行5-HT能纤维,这与HE和髓鞘染色组织病理学观察到的结果相一致。磁刺激后,5-HT在头尾端的密度均有明显增加,但仍没有达到正常对照组水平。重复经颅磁刺激增加了脊髓损伤后5-HT递质分泌,其机制推测为重复经颅磁刺激通过直接或间接途径激活了残存5-HT能下行纤维胞体,使其递质合成代谢增加,改善了轴浆运输,递质分泌增加,部分恢复了上位中枢对脊髓远端的调控。通过