实验15-微核的诱导和检测

实验15微核的诱导和检测微核（micronucleus）是染色体畸变的一种表现形式，为有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体片断，在间期细胞的细胞质中形成的一个或多个圆形或杏仁状结构。微核游离于主核之外，大小在主核的l/3以下。其折光率及细胞化学反应性质和主核一样，也具有合成DNA的能力。一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体断片产生的，但是已有实验证明，整条染色体或几条染色体也能形成微核。这些断片或染色体在有丝分裂过程中行动滞后，在分裂末期未能进入主核，便形成了独立于主核之外的核物质块。当子细胞进入下一次分裂间期时，它们便浓缩形成主核之外的小核，即形成微核。在环境污染物中存在着许多具有诱变活性的物质，能直接或间接地诱发生物体发生基因突变（mutation）、染色体畸变（chromosomeaberration）等细胞遗传损伤，染色体畸变在细胞分裂间期中以微核的形式表现出来，而微核产生的概率又可与诱变因子的剂量呈正比，因此可以用微核出现的频率来评价环境诱变因子对生物的诱变影响。目前，常用的微核检测技术主要有骨髓微核试验和蚕豆根尖微核试验，可应用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、食品添加剂、环境检测的安全评价及染色体遗传疾病和癌症前期诊断等各个方面。小鼠骨髓嗜多染红性细胞微核试验：1959年，Evans等人首先提出用微核试验检测细胞遗传损伤，1966年，Schroeder推荐用骨髓微核试验代替相对麻烦费时的骨髓细胞中期染色体畸变试验来研究受试物的有丝分裂毒性（mitotictoxicity）和断裂剂效应（calstogeneffect）。此后，Schmid、Heddle等人在鉴别小鼠骨髓嗜多染性红细胞（Polychromaticerythrocyte，PCE）的基础上建立了哺乳类脊髓微核试验方法，目前已经成为一个相当成熟的标准化体内检测系统。具体方法为：（1）染毒：在小鼠腹腔注射受试物。（2）取材：染毒24h后以颈椎脱臼法处死小鼠，取出两根股骨，剔净肌肉，用纱布擦掉附在股骨上的血污，剪掉股骨头。以lml注射器吸取小牛血清冲洗骨髓腔，将骨髓细胞冲入青霉素小瓶中制成悬液。（3）制片：将骨髓细胞悬液移入离心管中，1000r/min离。5～10min。弃去上清液，留少量液体混匀后，按血常规涂片法涂片，待干后再置甲醇溶液中固定5～10min。（4）染色：1：l0Giemsa染液染色10min，树胶封片。（5）观察：骨髓嗜多染红细胞呈灰蓝色，成熟红细胞呈橘红色。微核大多数呈圆形或椭圆形，边缘光滑整齐，嗜染性与核质一致，呈紫红色或蓝紫色。每只动物计数1000～2000个嗜多染红细胞。蚕豆根尖微核试验：蚕豆根尖微核试验1986年已被中国环保局列为一种环境生物测试的规范方法，它作为一种环境变异的检测手段，在我国不少地区的环保部门和医疗卫生系统中都有广泛的应用。蚕豆根尖微核试验具有准确、快速、操作简便、有明显剂量-效应关系、适合大批量样品检测等特点。美国国家环保局也肯定了蚕豆根尖微核试验在环境突变性检测中的作用，对许多环境致癌物都作了标准化的试验，建立了庞大的数据库，并建议在全世界范围内推广。其操作步骤如下：（1）材料准备：取蚕豆种子在蒸馏水中浸泡24h，使种子充分吸胀，置于有滤纸的瓷盘中并盖上湿纱布，在23±1℃的光照培养箱中培养l～2d，使其长出1.5～3.0cm长的初生根，此时切除初生根以保证侧根的生长发育。（2）染毒处理：待侧根露白后，随机分组。每组选择10粒种子用配制好的溶液染毒处理6h，取出后用蒸馏水冲洗，并移至蒸馏水中修复培养22～26h(两个细胞周期)。（3）材料固定：取修复培养结束的蚕豆根尖0.5～1cm于卡诺氏固定液中固定12～14h。（4）材料解离：将固定后的根尖材料用0.1mol·L－1。的盐酸在60℃（5）制片：将解离后的根尖材料用蒸馏水漂洗数次，取出置于载片上，从根冠起切取根尖1～1.5mm，用解剖针捣碎，加l～2滴染液，染色10～15min。盖上盖玻片轻压。（6）镜检：在40×10倍显微镜下，凡小于主核1/4以下的，同主核有相同染色效果的，圆形、椭圆形或其他类似的形状的染色物质都可以算作微核。根据附表统计微核。（7）微核的定量表示：通常每一处理组至少观察5张较好的片子，每张片子至少观察1000个以上细胞。结果有两种表示方法：①微核率‰=微核数观察统计的总细胞数×1000‰②微核细胞率‰=具有微核的细胞数观察统计的总细胞数×1000‰【实验目的】了解微核的发生机制和监测方法；初步掌握实验方案设计、数据整理及结果分析和论文撰写等基本技能。【实验器材、材料和药品】1．器材低速离心机、显微镜、光照培养箱、计数器、1ml注射器、青霉素小瓶、解剖器械、离心管、吸管、纱布等。2．试剂及其配制小牛血清（FCS）甲醇溶液Giemsa染液磷酸盐缓冲液(PBS)（pH6.8）卡洛氏液70%乙醇1.0mol·L-1盐酸1.0mol·L-1氢氧化钠溶液1%醋酸洋红诱变剂：物理或化学诱变剂（自选）3．材料小鼠、蚕豆【实验方法和步骤】1．查阅资料，选题由教师提供课题，学生选定研究课题；或由学生查阅资料、根据细胞生物学理论课所学知识，就以上实验目的以小组为单位，自行命题，报教师审批。选择诱导微核的诱变剂和受体材料。2．查阅资料，灵活运用所学知识和技能设计实验根据选择的课题，利用图书馆、网络等资源广泛查阅资料，讨论，设计实验方案包括确定诱导条件（如诱导剂的浓度、诱导时间等）、确定合适的微核检测方法和步骤。将实验方案交给并交教师审阅、修改、完善，经教师审批后方可实施。3．实施并完成自行设计的实验根据实验设计技术路线，进行实验前的准备工作，实验用复杂溶液配置可在老师指导下配置，实验过程中要严格遵守操作规程，独立完成。并做好实验记录，向教师报告实验情况和结果，经教师批准后方可结束实验。