ligation independent cloning-分子克隆技术课件

Ligation-independentcloning2011.12.19ligationindependentcloning-分子克隆技术经典的克隆方法经典的克隆方法，主要分为以下两种：(1)粘性末端连接，即载体质粒和待插入的外源片段都通过合适的限制性内切酶切割，产生相互匹配的粘性末端，然后在连接酶作用下重新形成磷酸二酯键而得到环化的重组质粒；(2)平末端连接，平末端连接中，载体和片段均为平端，都没有粘性末端突出。优点：依赖连接酶的克隆方法简单高效，是克隆单个基因的常用的方法。不足：一方面，插入片段要经过限制性内切酶处理，这样在实验设计时就要考虑目的基因的DNA序列，不能实现多基因的平行操作，不适合高通量；另一方面，该过程使用连接酶，不但延长了实验的周期，而且也会带来载体自连背景，增加了筛选工作量。PCR双酶切双酶切连接ligationindependentcloning-分子克隆技术ligation-independentcloning在很多情况下，重组DNA技术的应用都会受到基因序列中原有的酶切位点的限制，尤其是多基因片段的重组往往更容易受到限制酶酶切位点序列的限制，研究者不得不使用一些非常稀有的酶切位点或者采用其它的DNA重组方法，大大增加了DNA重组的工作量和难度。因此，开发一种不受序列限制而且需要准确重组的新方法就显得十分重要。Aslanidis和deJong(1990)在1990年所提出的不依赖连接反应克隆(ligation-independentcloning,LIC)充分满足了上述要求。这种方式不仅克服了常规依赖连接酶克隆方法的缺点，而且操作简便、方法快捷及连接效率高，应用日益广泛。在T4DNA聚合酶的3′-5′外切酶活性下和一种特定的dNTP存在的缓冲液条件下反应，插入片段能产生10~15个碱基的粘性末端(AslanidisanddeJong,1990)。载体和PCR片段依靠长的粘性末端重组，此过程不需要连接酶。这种克隆方法不需要考虑插入片段的序列，任何基因都能被克隆到该载体中。而且，整个流程简单到不需要任何限制性内切酶和连接酶，两者在体外条件下孵化，互补的粘性末端退火形成环状分子，经转化进大肠杆菌细胞后，细菌的修复系统修复这些突出和缺口而得到正确重组子(如图)。刘超等,2011,不依赖于连接反应克隆(LIC)的技术进展,基因组学与应用生物学,Vol.30No.13(DOI:10.5376/.2011.30.0013)ligationindependentcloning-分子克隆技术LIC方法的特点LIC方法依赖于T4DNA

Polymerase的核酸外切酶活性，这样就要求被处理的线性载体和片段的末端仅含有3种碱基，这样才可以有效控制反应以产生特定大小的粘性末端。要求载体有较固定的粘性末端，且对于如何使载体线性化有特殊的要求。LIC方法的优势在于：(1)待克隆的PCR片段不需要限制性内切酶处理。这样就省去了在设计引物时考虑各种酶切位点的麻烦，而且实验过程中可以实行并行操作，对所有的样品进行同样的处理。(2)速度快。T4

DNAPolymerase所需的时间只要40min，然后75℃热处理20min，载体与目的片段共混孵育10min。相比经典的克隆方法更节约时间。(3)克隆效率高且操作简便。如前所述，该方法不依赖连接酶，完全是靠粘性末端配对退火，所以不匹配的末端不可能形成双链，载体自连背景低。(4)相对而言费用较低。该方法中所需要的引物虽然有额外10~15bp附加碱基，但是相对而言位点特异性重组中所要求的引物是较短的，而且克隆过程中省去了连接酶，也没有使用价格不菲的特殊重组酶。综合以上几个方面考虑，LIC是一种适合于高通量基因克隆和蛋白质表达的优秀方法。ligationindependentcloning-分子克隆技术LIC方法的改进——SLIC在很多情况下，DNA片段的克隆和表达，尤其是多基因片段的重组往往会受到限制酶酶切位点序列的限制，因此，建立一种不受序列限制而且需要准确重组的新方法就显得十分重要．Li&Elledge所建立的不依赖序列和连接的克隆方法(sequenceandligation-independentcloning，SLIC)就能满足上述要求．该方法不受DNA序列的限制，可以将任意序列的多个DNA片段组装到一起，而且不需要连接反应即可完成体外的重组．该方法的基本原理如下：利用PCR技术在插入片段的两侧分别加上几十bp的同源末端，参加重组的片段分别在没有dNTP存在的情况下用T4DNA聚合酶中的3’-5’外切酶活性22℃处理，产生含有同源序列的5端突起．突出端的长度可以通过控制3’-5’外切酶活性的作用时间来实现，加入dCTP即可终止外切酶活性．将各片段的酶切产物按等摩尔比混合，在T4DNA连接缓冲液中于37℃完成突出单链的复性重组，形成含有大的缺口的环状中间体．用此中间体转化大肠杆菌，利用大肠杆菌本身的修复机制完成中间体的修复．SLIC用途广泛，它不仅可用于任何2个DNA片段的重组，而且可用于多个DNA片段的重组．刘超等,2011,不依赖于连接反应克隆(LIC)的技术进展,基因组学与应用生物学,Vol.30No.13(DOI:10.5376/.2011.30.0013)ligationindependentcloning-分子克隆技术ligation-independentVectorsVectorTagExpressionHostResistanceTag(s)Size2BTHis6-tev-yORFE.coliT7AMP2kDa2CTHis6-MBP-N10-tev-yORFE.coliT7AMP45kDa2GTHis6-GST-tev-yORFE.coliT7AMP28kDa2NTHis6-NusA-tev-yORFE.coliT7AMP58kDa2STHis6-Sumo-tev-yORFE.coliT7AMP14kDayORF(youropenreadingframe)ligationindependentcloning-分子克隆技术Solubility-EnhancingTags促溶标签通常是一些可以增强融合蛋白表达量及溶解性的大分子量的多肽或者蛋白。一些融合标签如GST、MBP因为同时可以用作亲和层析的标签，所以经常被用在蛋白纯化过程中。而一些其他的融合标签，如NusA,thioredoxin(TRX),smallubiquitin-likemodifier(SUMO),andubiquitin(Ub)则需要添加额外的亲和标签来用于蛋白纯化。并不存在某一种融合标签可以解决所有蛋白的表达及溶解性问题。然而，实践证明某些融合标签在促进溶解性方面比别的蛋白更有优势。有研究表明这些融合标签在促进表达量方面和溶解性的作用是不同的。TRX>SUMO~NusA>Ub~MBP~GST.（表达量）SUMO~NusA>Ub~GST~MBP~TRX.（溶解性）因此，SUMO和NusA是相对比较理想的促进表达量及溶解性的选择。【参考】FusionTagsforProteinExpressionandPurificationligationindependentcloning-分子克隆技术NusA标签NusA融合蛋白表达系统于1999年由Davis发明，并在2000年由Novagen首先进行商业化设计和开发，特别推荐用于以NusA作为N端标签时提高在大肠杆菌中难溶的重组表达蛋白的可溶性。已有充分的证据证明NusA标签系统能显著提高多种不同来源蛋白的可溶性表达，而这些蛋白在单独表达时往往形成不可溶的包涵体。在一些研究报告中，用蛋白酶切除NusA标签能使目的蛋白仍保持正确折叠和生物学活性；相反，在另外许多报道中也指出当目的蛋白与NusA融合而非切除时，融合蛋白也同样具有活性。NusA标签系统的成功至少部分地是由于其与大肠杆菌分子伴侣系统相互作用的结果。NusA标签提高蛋白可溶性的可能机制：Houry（1999）等揭示NusA蛋白是分子伴侣GroEL在体内的必须底物。而GroEL与其共作用因子GroES是大肠杆菌唯一的在所有生长条件下必需的分子伴侣系统。Douette等（2005）研究了融合蛋白NusA-UCP1（uncouplingprotein1）的可溶产量。UCP1是一种线粒体膜蛋白。这些作者发现16℃培养时，当GroEL共过表达的情况下，融合蛋白的可溶性有更大的提高。这个结果也表明NusA与分子伴侣途径相作用，从而阻止参与蛋白的聚集。

【参考】NusA技术：显著增强大肠杆菌表达可溶、活性蛋白：ligationindependentcloning-分子克隆技术>2BTEcoliT7ColE1-oriLICv1transferHis6-tev-yORFAMP（全长4876bp）TTCTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAACATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGCAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATACACTCCGCTATCGCTACGTGACTGGGTCATGGCTGCGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGGCAGCTGCGGTAAAGCTCATCAGCGTGGTCGTGAAGCGATTCACAGATGTCTGCCTGTTCATCCGCGTCCAGCTCGTTGAGTTTCTCCAGAAGCGTTAATGTCTGGCTTCTGATAAAGCGGGCCATGTTAAGGGCGGTTTTTTCCTGTTTGGTCACTGATGCCTCCGTGTAAGGGGGATTTCTGTTCATGGGGGTAATGATACCGATGAAACGAGAGAGGATGCTCACGATACGGGTTACTGATGATGAACATGCCCGGTTACTGGAACGTTGTGAGGGTAAACAACTGGCGGTATGGATGCGGCGGGACCAGAGAAAAATCACTCAGGGTCAATGCCAGCGCTTCGTTAATACAGATGTAGGTGTTCCACAGGGTAGCCAGCAGCATCCTGCGATGCAGATCCGGAACATAATGGTGCAGGGCGCTGACTTCCGCGTTTCCAGACTTTACGAAACACGGAAACCGAAGACCATTCATGTTGTTGCTCAGGTCGCAGACGTTTTGCAGCAGCAGTCGCTTCACGTTCGCTCGCGTATCGGTGATTCATTCTGCTAACCAGTAAGGCAACCCCGCCAGCCTAGCCGGGTCCTCAACGACAGGAGCACGATCATGCGCACCCGTGGCCAGGACCCAACGCTGCCCGAGATGCGCCGCGTGCGGCTGCTGGAGATGGCGGACGCGATGGATATGTTCTGCCAAGGGTTGGTTTGCGCATTCACAGTTCTCCGCAAGAATTGATTGGCTCCAATTCTTGGAGTGGTGAATCCGTTAGCGAGGTGCCGCCGGCTTCCATTCAGGTCGAGGTGGCCCGGCTCCATGCACCGCGACGCAACGCGGGGAGGCAGACAAGGTATAGGGCGGCGCCTACAATCCATGCCAACCCGTTCCATGTGCTCGCCGAGGCGGCATAAATCGCCGTGACGATCAGCGGTCCAGTGATCGAAGTTAGGCTGGTAAGAGCCGCGAGCGATCCTTGAAGCTGTCCCTGATGGTCGTCATCTACCTGCCTGGACAGCATGGCCTGCAACGCGGGCATCCCGATGCCGCCGGAAGCGAGAAGAATCATAATGGGGAAGGCCATCCAGCCTCGCGTCGCGAACGCCAGCAAGACGTAGCCCAGCGCGTCGGCCGCCATGCCGGCGATAATGGCCTGCTTCTCGCCGAAACGTTTGGTGGCGGGACCAGTGACGAAGGCTTGAGCGAGGGCGTGCAAGATTCCGAATACCGCAAGCGACAGGCCGATCATCGTCGCGCTCCAGCGAAAGCGGTCCTCGCCGAAAATGACCCAGAGCGCTGCCGGCACCTGTCCTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACAGTCATAAGTGCGGCGACGATAGTCATGCCCCGCGCCCACCGGAAGGAGCTGACTGGGTTGAAGGCTCTCAAGGGCATCGGTCGACGCTCTCCCTTATGCGACTCCTGCATTAGGAAGCAGCCCAGTAGTAGGTTGAGGCCGTTGAGCACCGCCGCCGCAAGGAATGGTGCATGCAAGGAGATGGCGCCCAACAGTCCCCCGGCCACGGGGCCTGCCACCATACCCACGCCGAAACAAGCGCTCATGAGCCCGAAGTGGCGAGCCCGATCTTCCCCATCGGTGATGTCGGCGATATAGGCGCCAGCAACCGCACCTGTGGCGCCGGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCGAGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGTGCCGGCTCCGGAGAGCTCTTTAATTAAGCGGCCGCCCTGCAGGACTCGAGTTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAAATCTTCTCACCATCACCATCACCATGAAAACCTGTACTTCCAATCCAATATTGGAAGTGGATAACGGATCCGCGATCGCGGCGCGCCACCTGGTGGCCGGCCGGTACCACGCGTGCGCGCTGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGATATCCACAGGACGGGTGTGGTCGCCATGATCGCGTAGTCGATAGTGGCTCCAAGTAGCGAAGCGAGCAGGACTGGGCGGCGGCCAAAGCGGTCGGACAGTGCTCCGAGAACGGGTGCGCATAGAAATTGCATCAACGCATATAGCGCTAGCAGCACGCCATAGTGACTGGCGATGCTGTCGGAATGGACGATATCCCGCAAGAGGCCCGGCAGTACCGGCATAACCAAGCCTATGCCTACAGCATCCAGGGTGACGGTGCCGAGGATGACGATGAGCGCATTGTTAGATTTCATACACGGTGCCTGACTGCGTTAGCAATTTAACTGTGATAAACTACCGCATTAAAGCTTATCGATGATAAGCTGTCAAACATGAGAACCTGTGGCGCCGGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCGAGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGTGCCGGCTCCGGAGAGCTCTTTAATTAAGCGGCCGCCCTGCAGGACTCGAGTTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAAATCTTCTCACCATCACCATCACCATGAAAACCTGTACTTCCAATCCAATATTGGAAGTGGATAACGGATCCGCGATCGCGGCGCGCCACCTGGTGGCCGGCCGGTACCACGCGTGCGCGCTGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGATATCCACAGGACGGGTGTGGTCGCCATGATCGCGTAGTCGATAGTGGCTCCAAGTAGCGAAGCGAGCAGGACTGGGCGGCGGCCAAAGCGGTCGGACAGTGCTCCGAGAACGGGTGCGCATAGAAATTGCATCAACGCATATAGCGCTAGCAGCACGCCATAGTGACTGGCGATGCTGTCGGAATGGACGATATCCCGCAAGAGGCCCGGCAGTACCGGCATAACCAAGCCTATGCCTACAGCATCCAGGGTGACGGTGCCGAGGATGACGATGAGCGCATTGTTAGATTTCATACACGGTGCCTGACTGCGTTAGCAATTTAACTGTGATAAACTACCGCATTAAAGCTTATCGATGATAAGCTGTCAAACATGAGAAT7promoterprimerTEV酶切位点：ENLYFQ^SSspI酶切位点：AAT^ATTT7terminatorprimer2BTligationindependentcloning-分子克隆技术PCR引物设计引物设计：先设计与目的序列对应的18-21bp的匹配区(匹配区域的序列长度可根据实际情况进行调整)，再在5’端加上LICtagsequence：PCRT4

DNAPolymerase

+dCTP处理后ligationindependentcloning-分子克隆技术LICprotocol设计PCR引物：正向：5’-TACTTCCAATCCAATGCA+目的匹配序列-3’反向：5’-TTATCCACTTCCAATGTTATTA+互补配对序列-3’PCR，并切胶回收目的条带T4聚合酶处理(20μL)：5μLPurifiedPCR2μLT4buffer0.5μLdCTP(100mM)1μL100mMDTT1μLT4polymerase(1U/μL)10.5μLH2O22℃反应40min后，75℃热处理20min使酶失活。LIC质粒抽提(500ng)SspI单酶切，使质粒线性化切胶回收线性化的质粒T4聚合酶处理(20μL)：10μLLinearizedVector2μLT4buffer0.5μLdGTP(100mM)1μL100mMDTT1μLT4polymerase(1U/μL)5.5μLH2O(在维持质粒与酶的比例前提下，酶切体系可以适当放大)22℃反应40min后，75℃热处理20min使酶失活。2μLLICedinsert+2μLLICedvector+6μLH2O，室温下孵育5-30min后，取5μL转化top10.！！！！ligationindependentcloning-分