谷糠抗结肠癌结合态多酚的制备及其机制研究

谷糠抗结肠癌结合态多酚的制备及其机制研究随着人们生活水平的提高,饮食结构发生了改变,再加上食物中的农药残留、食品添加剂的不合理使用等加快了消化系统肿瘤的发病率。结肠癌（colorectalcancer,CRC）是一种最常见的消化系统恶性肿瘤,目前的治疗手段主要是手术和化疗,其极易复发,同时产生耐药性,具有较强的毒副作用。近年来从天然产物中已获得多种抗结肠癌临床药物,如:紫杉醇,依立替康和长春新碱等多种小分子药物。以上三大类抗结肠癌临床药物均来源于天然产物。因此,天然产物是药物筛选的巨大宝库,从天然产物中获取高效无毒的抗结肠癌药物也是目前国内外肿瘤药物研发的热点。我国天然产物资源丰富又有源远的药用历史,利用天然产物资源的优势,一直以来是我国新药开发的主要方向。谷子（Setariaitalica）是我国黄河流域传统的农作物,属一年生禾本科植物,是山西的名优产品,现在已广泛种植于全世界。谷糠是在小米加工过程中作为副产品被丢弃而生物利用度不高的谷子的皮壳。研究表明,谷糠含有丰富的植物化学物质,尤其是多酚类化合物。多酚主要以自由态和结合态两种形式存在于自然界,以结合态形式居多并且比自由态多酚具有更强的抗氧化能力。有报道揭示结合态多酚具有广泛的药理和医学特性,归功于它具有清除自由基、螯合金属和较强的抗氧化特性。因此,将结合态多酚作为预防和治疗氧化应激相关疾病的潜在药物,越来越受到科学界的关注。本研究以天然谷糠为原料,从中提取出一系列多酚化合物,并对每个多酚的含量作了比较。在细胞水平筛选具有抗结肠癌活性的多酚并对其成分进行鉴定,确定其有效成分;采用细胞和裸鼠模型,从细胞凋亡、炎症效应及细胞代谢的角度系统探讨谷糠活性多酚抗结肠癌的分子机制。主要研究内容及结果如下:（1）谷糠多酚的制备及抗氧化能力的评价。采用丙酮提取谷糠内外壳自由态多酚,将提取完自由态多酚的谷糠内外壳残渣进一步碱消化,制备结合态多酚。福林酚法测定总多酚含量,结果显示谷糠外壳结合态多酚的含量最高,其次是内壳的结合态多酚（BPIS,boundpolyphenolofinnershell）。采用MTT法和细胞克隆实验,发现只有谷糠内壳来源的结合态多酚具有显著抗结肠癌活性并且对其它肿瘤细胞也具良好的抗增殖效果,将其命名为:BPIS。另外,实验结果显示BPIS的抗氧化能力比维生素C的抗氧化性更强。（2）谷糠结合态多酚BPIS成分鉴定。通过UPLC-Triple-TOF液质联用技术鉴定出BPIS含有12种多酚成分,分别是香草酸4-O-β-D–吡喃糖苷,葡萄糖基丁香酸、阿魏酸4-O-β-D–吡喃糖苷、4-羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、对-香豆酸、牡荆素、阿魏酸、异阿魏酸、二聚体阿魏酸衍生物和二聚体肉桂酸衍生物等成分。MTT检测结果发现,BPIS比其分子量小于200的组分抗结肠癌效果更佳。（3）BPIS诱导结肠癌细胞凋亡的分子机制。将细胞内ROS通过被DCFH-DA荧光探针标记,结果显示BPIS能够显著升高结肠癌HCT-116细胞内ROS含量。采用流式细胞仪检测发现,BPIS能够显著降低HCT-116细胞的线粒体膜电位。Westernblotting检测结果显示caspases家族蛋白caspase-9和caspase-3被BPIS剪切激活且具有浓度依赖性,伴随着促凋亡蛋白Bax的表达量增加,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量减少。上述结果证明BPIS能够诱导结肠癌HCT-116细胞发生线粒体介导的凋亡效应,且BPIS诱导的凋亡效应能够被ROS的抑制剂NAC显著逆转,表明BPIS通过增加HCT-116细胞内ROS的含量而诱导细胞凋亡。（4）BPIS发挥抗炎效应的分子机制。采用脂多糖（LPS）构建结肠癌HT-29细胞炎症模型并用ELISA检测细胞内炎症因子,发现BPIS能够显著抑制促炎因子IL-1β和IL-6的分泌,增加抗炎因子IL-10的分泌。Westernblotting结果显示,BPIS能够阻滞HT-29细胞中炎症相关转录因子NF-κB蛋白的表达和核转位,并且抑制总Akt蛋白和p-Akt^ser473蛋白的表达。采用Akt蛋白的激活剂IGF-1（Insulin-likeGrowthFactors）与BPIS共处理HT-29细胞,结果显示IGF-1逆转了BPIS对p-Akt^ser473蛋白和NF-κB-p65蛋白的抑制作用,表明p-Akt^ser473蛋白正调控NF-κB蛋白的表达和核转位。双荧光素酶报告载体分析揭示,Akt是miR-149的靶基因,RT-PCR结果显示BPIS能显著升高HT-29细胞中miR-149的表达。采用DCFH-DA荧光探针标记HT-29细胞内ROS,结果显示BPIS能够明显升高HT-29细胞内ROS水平。将ROS抑制剂NAC与BPIS共处理HT-29细胞,RT-PCR结果显示NAC能显著逆转BPIS对miR-149的上调作用。结果表明BPIS通过促进HT-29细胞中ROS的产生,上调miR-149的表达,抑制其靶基因Akt及其下游炎症转录因子NF-κB蛋白的表达,阻滞多种促炎症因子的分泌,以此BPIS发挥了显著地抗结肠癌炎症效应。（5）BPIS逆转结肠癌能量代谢的分子机制。本论文研究发现BPIS能够显著减弱结肠癌HT-29细胞对葡萄糖的消耗和乳酸的产生,并且通过抑制糖酵解过程中关键限速酶PKM2蛋白的表达致使细胞糖酵解速率降低。细胞外酸化率（ECAR）实验结果表明,BPIS能显著减弱HT-29细胞的糖酵解速率。说明BPIS有效地减弱了HT-29细胞的有氧糖酵解。另一方面BPIS能通过显著降低GLS的酶活性抑制SLC蛋白在RNA水平和蛋白质水平的表达,进而抑制HT-29细胞的谷氨酰胺代谢过程。结果还显示,BPIS能够抑制c-myc蛋白的表达,表明BPIS逆转的是c-myc介导的结肠癌细胞代谢。本论文已证明BPIS能够显著上调HT-29细胞中miR-149的表达。因此推测miR-149与c-myc蛋白具有负调控的关系。采用miRDB软件和KEGG信号通路数据库搜集miR-149与代谢通路相关的靶基因,通过miRNA靶基因数据库Miranda和TargetScan预测可以和miR-149结合的靶基因的非编码区,通过双荧光酶报告系统揭示c-myc就是miR-149的靶基因,同时验证了上述二者能够负调控的推断。MTT和细胞克隆实验发现,BPIS能够显著抑制结肠癌HT-29和DLD1细胞的增殖;而且miR-149抑制剂能够显著逆转BPIS对结肠癌HT-29和DLD1细胞的抑制作用,表明BPIS通过上调miR-149的表达而逆转c-myc介导的结肠癌细胞异常能量代谢来发挥抗结肠癌效应。（6）构建裸鼠结肠癌细胞皮下成瘤模型。采用裸鼠腹腔给药的方式,每隔2天给药一次（共注射7次）。结果显示BPIS能够显著抑制结肠癌肿瘤的生长,而裸鼠的正常体重和生长状况不受影响。采用Westernblotting和免疫组化验证BPIS在细胞水平已证实的关键因子表达情况,如miR-149,p-Akt^ser473,NF-κB,PKM2,c-myc等。结果显示BPIS在体内也具有明显抗结肠癌效应,与细胞水平的数据一致。综上所述:BPIS是一种来源于谷糠内壳的结合态多酚,该多酚由12种成分组成。BPIS中分子量小于200的组分具有明显的抗结肠癌活性,但没有总BPIS的抗结肠癌活性效果好。本文就总BPIS发挥抗结肠癌效应的分子机制进行深入探讨,并通过裸鼠肿瘤模型进行验证。BPIS处理可以诱导结肠癌细胞产生过量的ROS,过量的ROS一方面激活线粒体介导的凋亡效应,另一方