酶类药物的分析

关于酶类药物的分析12

第一节

概述在生物体内，酶能降低生化反应活化能，加快可逆反应的进行速度，使之尽快达到平衡。一、酶的特性二、酶的分类三、酶的化学组成四、酶的催化反应机制五、酶催化反应动力学第2页,共58页，2024年2月25日，星期天3一、酶的特性

1．酶是高效催化剂。

2．酶对底物的结构具有严格的选择性。

（1）相对专一性：（2）绝对专一性:（3）立体异构专一性:3．酶催化反应的反应条件温和。4．酶的催化活性在生物体内受多种因素的调节。第3页,共58页，2024年2月25日，星期天4二、酶的分类氧化还原酶转移酶水解酶裂合酶异构酶合成酶（或称连接酶）第4页,共58页，2024年2月25日，星期天5三、酶的化学组成

分为简单酶和结合酶两大类。结合酶类中除含有蛋白外，还含有某种热稳定的非蛋白质的小分子物质，二者结合起来，称为“全酶”，才呈现生物催化活性。结合酶=酶蛋白+辅助因子第5页,共58页，2024年2月25日，星期天6四、酶的催化反应机制

1．酶-底物复合物的形成

在酶促反应中，反应底物首先与酶分子上活性部位结合，形成酶-底物复合物，降低反应的活性能，使酶促反应顺利进行。2．酶-底物复合物加速反应速率的原因（1）定向作用与底物浓缩

（2）酶使底物分子变形

（3）酸碱催化（4）共价催化

。第6页,共58页，2024年2月25日，星期天7五、酶催化反应动力学

酶的活力单位

酶活性单位（U）是酶活性高低的一种量度，用U/g或U/ml表示。酶活力单位定义：在规定的条件下，每分钟能转化1μmol底物所需要的酶量，称一个酶的活力单位。酶的比活力

每毫克酶蛋白所含酶活力，U/mg。

第7页,共58页，2024年2月25日，星期天8Michaelis-Menten快速平衡学说底物浓度的增加，反应速度上升呈双曲线。在低底物浓度时，反应速度呈直线上升，表现为一级反应。在高浓度时，反应速度达到一个极限值，呈现零级反应。第8页,共58页，2024年2月25日，星期天9米氏方程酶反应动力学方程式：

V——反应初速度Vm——最大反应速度Ks—米氏常数，Ks=K－1/K1，Ks为ES的解离常数，表示酶与底物的亲和力。Ks为反应速度V是最大反应速度Vm一半时所需底物浓度，即V=1/2Vm时，Ks=[S]。第9页,共58页，2024年2月25日，星期天10Briggs-Haldane稳态学说

ES的形成速度与ES的解离速度相等，达到动态平衡，即“稳态”，反应方程式：Km取代了Ks，当V=1/2Vm时，Km=[S]。Km也可表示为底物与酶的亲和力。第10页,共58页，2024年2月25日，星期天11第二节

酶类药物的鉴别与检查鉴别方法常用蛋白质鉴别方法，如在碱性条件下的双缩脲反应。专用于酶的鉴别方法：

酶活性试验：与特异性底物反应（胰蛋白酶）。沉淀试验：胃蛋白酶动物试验：透明质酸酶水解粘多糖。

第11页,共58页，2024年2月25日，星期天12酶类药物的检查

酶类药物是生化产品和微生物发酵产品，在生产过程中可能带入微量的脂肪类物质、其他的酶类和大分子杂质，影响酶质量，需有含量限度。第12页,共58页，2024年2月25日，星期天13酶类药物的检查（一）脂肪含量限度检查检查方法，乙醚浸提，干燥，精密称定，脂肪不得过规定的含量。（二）其他酶类含量限度检查胰蛋白酶、糜蛋白酶均是从牛、猪的胰脏中提取的蛋白分解酶。提取胰蛋白酶时又易带入微量的糜蛋白酶。（三）大分子活性物质含量限度检查第13页,共58页，2024年2月25日，星期天14胰蛋白酶制品中糜蛋白酶的含量每2500U胰蛋白酶中不得多于50U的糜蛋白酶。糜蛋白酶专属水解芳香氨基酸（L-酪氨酸、L-苯丙氨酸）的羧基形成的肽键、酰胺键和酯键。用N-乙酰-L-酪氨酸乙酯（N-Acetyl-L-TyrosineEthylester，ATEE）作底物，通过分光光度法测定此酶对底物的水解速率来检查该酶的含量限度。第14页,共58页，2024年2月25日，星期天15第三节酶活力测定方法固定时间法

连续监测法

（一）、需NAD+或NADP+作指示的连续监测法：直接测定法

偶联法三联酶活测定（二）、不需NAD+或NADP+作指示的连续监测法：固定浓度法

第15页,共58页，2024年2月25日，星期天16一、固定时间法

在适宜的条件下，使酶和底物共同保温一定时间，然后测定产物生成的量或底物消耗的量从而间接推算出酶的含量（或活力）。

[E]表示酶浓度，[P]为反应产物浓度，t表示酶作用时间，K为常数。第16页,共58页，2024年2月25日，星期天17注意事项缺点：无法了解整个反应过程是否都是零级反应。注意事项：1、底物饱和2、时间第17页,共58页，2024年2月25日，星期天18二、连续监测法

在酶反应过程中，连续记录不同时间的底物消耗量或产物生成量。

（一）、需NAD+或NADP+作指示的连续监测法（二）、不需NAD+或NADP+作指示的连续监测法第18页,共58页，2024年2月25日，星期天19（一）、需NAD+或NADP+作指示的连续监测法：还原型辅酶（NADH和NADPH）在340nm处有紫外吸收，氧化型辅酶（NAD+和NADP+）在340nm处无紫外吸收.利用340nm处每分钟吸收度升高或降低的速率与酶活性成正比的关系，推算出酶的活力单位。包括：直接测定法

偶联法三联酶活测定

第19页,共58页，2024年2月25日，星期天20直接测定法大多数需NADH（NADPH）参加的脱氢酶，可利用紫外分光光度法直接测定反应体系在340nm处吸收度的变化，计算酶活力单位。丙酮酸＋NADH＋H+ 乳酸＋NAD+340nm处吸收度降低的速率与NADH的氧化速率成正比，与LDH的活力成正比。第20页,共58页，2024年2月25日，星期天21偶联法此类酶催化反应不需NAD+或NADP+，但当与需NAD+或NADP+的脱氢酶反应偶联以后，能用紫外分光光度法测定.由脱氢酶引起的反应为指示反应，脱氢酶是指示酶，指示酶活力要比测定酶活力至少大100倍。例如：谷草转氨酶的测定：第21页,共58页，2024年2月25日，星期天22三联酶活测定引入一个辅助酶反应，将被测酶反应系统与指示酶反应系统联系起来，组成一个“三合一”酶反应系统，使底物转化率、辅助酶反应和NADH（NADPH）氧化速率之间成正比函数关系，辅助酶和指示酶的活力必须大大超过测定酶活力。例如：磷酸肌酸+ADP肌酸＋ATP……(1)葡萄糖＋ATPG-6-P＋ADP……(2)G-6-P+NADP+

葡萄糖酸-6-磷酸＋

NADPH＋H+

…(3)(1)被测反应，(2)辅助反应，HK（己糖激酶）辅助酶，(3)指示反应，

G-6-PDH（6—磷酸葡萄糖脱氢酶）指示酶。第22页,共58页，2024年2月25日，星期天23（二）不需NAD+或NADP+指示的连续监测法：酶底物大多是人工合成的“色素元”，其本身无色，经酶作用后释放出有色的反应产物。根据反应过程中吸收度增高速率，算出酶活力单位。例如：磷酸对硝基苯酚酯对硝基苯酚第23页,共58页，2024年2月25日，星期天24三、固定浓度法根据酶催化反应，使反应产物达到额定的浓度时其反应时间与酶浓度成反比的原理进行设计的。

[P]=K[E]t测定时间.以所需时间的倒数（1/t）对酶浓度作图即可制备标准曲线。优点：1、记录时间。2、准确第24页,共58页，2024年2月25日，星期天25二、底物与产物的测定方法（酶反应的检测方法）1、化学方法：用化学法测定其中某一底物或产物的变化值。2、分光光度法：

常用的有比色法和紫外分光光度法。3、荧光测定法：

简单、灵敏、快速。4、电化学分析法（1）

离子选择性电极分析法（2）

微电流法5、其他方法如测定气体的测压法，测定产物旋光度变化值的旋光测定法。第25页,共58页，2024年2月25日，星期天26第五节

酶类药物的检测

肽键水解酶

1、胰蛋白酶2、弹性蛋白酶3、尿激酶（气泡上升法）脂键水解酶——胰脂肪酶

糖苷键水解酶——溶菌酶其它（超氧化物歧化酶）第26页,共58页，2024年2月25日，星期天27一、肽键水解酶1、胰蛋白酶2、弹性蛋白酶3、尿激酶第27页,共58页，2024年2月25日，星期天281、胰蛋白酶—比色法胰蛋白酶：由牛、羊、猪等动物的胰脏中提取的一种蛋白水解酶。牛胰蛋白酶：233个氨基酸，分子量24000，等电点10.1。猪胰蛋白酶：214个氨基酸，分子量23400，等电点10.8。胰蛋白酶最适pH为7.6~8.0，电泳纯的胰蛋白酶的比活为8000单位/mg。第28页,共58页，2024年2月25日，星期天29原理胰蛋白酶专一作用于赖氨酸、精氨酸等碱性氨基酸的羧基组成的肽键、酰胺键及酯键，水解速度为酯键>酰胺键>肽键。BAEE(Benzoyl-L-Arginine-Ethyl-Ester)BAA(Benzoyl-L-Arginine-Anide)苯甲酰－L－精氨酸乙酯（BAEE）在胰蛋白酶的作用下，酯键被水解生成苯甲酰－L－精氨酸，在253nm波长处的吸收度随酶促反应递增，根据活力单位定义计算酶活力。第29页,共58页，2024年2月25日，星期天30测定法：取呈直线的吸收度，按下式计算：P为每mg供试中含胰蛋白酶的量，U；A1为直线上终止的吸收度；A2为直线上开始的吸收度；T为A1至A2读数的时间，min；W为测定液中供试品的量，mg；吸收度每分钟改变0.003，即相当于1个胰蛋白酶单位。第30页,共58页，2024年2月25日，星期天31

2、胰弹性蛋白酶胰弹性蛋白酶：为肽链内断酶，存在于哺乳动物胰脏。弹性酶用于治疗高血脂症、动脉粥样硬化和脂肪肝。胰弹性蛋白酶是由240个氨基酸组成的单一肽链，有四对二硫键。分子量为25900，等电点为pH9.5。胰弹性蛋白酶除水解弹性蛋白外，还可以水解血红蛋白、酪蛋白等蛋白。刚果红－弹性蛋白。第31页,共58页，2024年2月25日，星期天32原理刚果红－弹性蛋白法：以刚果红－弹性蛋白为底物，由于刚果红－弹性蛋白酶结合的共价键能被弹性酶水解，根据刚果红在495nm处有最大吸收，由标准曲线即可查得弹性酶单位数。单位：20分钟水解1mg刚果红－弹性蛋白所需的酶量为一个弹性酶活力单位。第32页,共58页，2024年2月25日，星期天33方法:

第33页,共58页，2024年2月25日，星期天343、尿激酶由人尿中分离提纯后制得的一种碱性蛋白水解酶。主要作用是激活人体内纤维蛋白溶解酶原使其成为有活性的纤维蛋白溶酶，从而解聚血纤维蛋白，溶解血栓。天然尿激酶的分子量为54000，其作用于纤维蛋白溶解酶原的赖氨酸或精氨酸键使其裂解成纤维蛋白溶解酶。第34页,共58页，2024年2月25日，星期天35效价测定原理(气泡上升法)尿激酶激活人体内纤维蛋白溶解酶原使其转化成纤维蛋白溶酶；纤维蛋白原在凝血酶的作用下，转变成纤维蛋白凝块，此凝块在纤维蛋白溶酶作用下，水解为可溶性小分子多肽。在纤维蛋白溶酶原过量的情况下，尿激酶量与纤维蛋白凝块的溶解时间的对数成直线关系。第35页,共58页，2024年2月25日，星期天36操作试管中加纤维蛋白原溶液0.3ml（37℃水浴）标准品溶液1.0ml加混合溶液0.4ml立即摇匀计时，反应系统应在30～45秒内凝结，当凝块内小气泡上升到系统体积一半时作为反应终点。以尿激酶的浓度为横坐标，以反应时间的对数为纵坐标。第36页,共58页，2024年2月25日，星期天37二、脂键水解酶－胰脂肪酶胰脂肪酶是一种水解酶，在一定条件下把甘油三脂类脂肪逐步水解，最后生成甘油及相应的脂肪酸。底物:橄榄油pH指示连续滴定法：稳定pH条件下避免因pH值改变而引起酶活力的改变。用已知浓度的标准碱溶液滴定，可定量地测定脂肪酸的量，从而得知脂肪酶活力。第37页,共58页，2024年2月25日，星期天38测定

第38页,共58页，2024年2月25日，星期天39计算每分钟水解橄榄油产生1μmol脂肪酸的酶量，为1个活力单位。每克含有的胰脂肪酶单位A:供试品消耗NaOH（0.1mol/L）的体积B:空白消耗NaOH（0.1mol/L）的体积W:供试品取样量（g）N:供试品稀释倍数。第39页,共58页，2024年2月25日，星期天40三、糖苷键水解酶－溶菌酶蛋清中提取的能分解粘多糖的碱性水解酶。主要作用于革兰氏阳性菌，使胞壁中的肽聚糖分解导致细菌溶解。溶菌酶具有抗菌、抗病毒等作用。溶菌酶分子量为14000～15000，由129个氨基酸残基组成，等电点为10.0~11.1。溶菌酶属糖苷水解酶，能以某些细菌细胞中的多糖为底物。第40页,共58页，2024年2月25日，星期天41效价测定－比浊法以溶酶小球菌为底物，主要成分为粘多糖，粘多糖由NAG和NAM重复而成。溶菌酶水解专属性强，它只能水解NAMC1和NAGC4之间的β－1，4糖苷键。溶酶小球菌胞壁中的粘多糖经过溶菌酶的水解作用后，菌体因渗透压不平衡，导致溶菌，溶液的吸收度下降。在一定的条件下，每分钟吸收度下降0.001为一个酶活力单位。第41页,共58页，2024年2月25日，星期天42比浊法测定计算：酶活力单位（u/mg）=W为测试液中供试品的重量（μg）第42页,共58页，2024年2月25日，星期天43比色法测定溶菌酶活性

用染料艳红K－2BP标记的M.Lysodeikticus为底物，酶催化细胞壁分解时游离出染色碎片（产物）反应后离心除去未分解底物，上清液比色，吸收度为溶菌酶活力的函数。第43页,共58页，2024年2月25日，星期天44溶菌酶效价测定－比色法

第44页,共58页，2024年2月25日，星期天45四、超氧化物歧化酶由哺乳动物红细胞分离而得的金属酶，能催化超氧化物游离基转化成过氧化氢和氧。来源于牛、猪、人红血球的超氧化物歧化酶（SOD）含铜和锌，分子量32000左右。SOD对热较稳定，在pH5.3~9.5范围内对酶活性影响不大。牛红细胞SODPI为4.95。第45页,共58页，2024年2月25日，星期天46效价测定SOD测定方法：直接法：直接测定反应过程中

O2-

的变化。间接法：同时使用氧自由基指示清除剂，SOD与指示剂清除剂竞争O2-，从而抑制指示剂清除剂与O2-

的结合，根据指示剂清除剂与O2-

反应速度的变化可间接测定SOD的活性。间接法包括：黄嘌呤氧化酶－细胞色素C法和联苯三酚法。第46页,共58页，2024年2月25日，星期天47黄嘌呤氧化酶－细胞色素C法原理：在有氧条件下，黄嘌呤氧化酶能催化黄嘌呤成尿酸，与此同时产生O2-，氧化型细胞色素C被O2-

还原为还原型细胞色素C，后者在550nm有最大吸收，因此测定氧化性细胞色素C在加入SOD前后的光吸收变化可间接计算酶活性。第47页,共58页，2024年2月25日，星期天48方法

第48页,共58页，2024年2月25日，星期天49注意点在特定条件下，25℃（pH7.8）每分钟抑制细胞色素C还原速率达50％所需要的酶量为一个活力单位。注意事项：重金属离子易使黄嘌呤氧化酶失活，因此反应体系中必须添加EDTA。反应体系中含过氧化氢酶可引起还原型细胞色素C发生过氧化作用，从而干扰检测的正确。第49页,共58页，2024年2月25日，星期天50联苯三酚法原理：在碱性条件下，联苯三酚会发生自氧化生成红酚，同时生成O2-。定义:在一定条件下，每分钟抑制联苯三酚自氧化速率达50％的酶量为一个酶活力单位。第50页,共58页，2024年2月25日，星期天51操作定义:在一定条件下，每分钟抑制联苯三酚自氧化速率达50％的酶量为一个酶活力单位。第51页,共58页，2024年2月25日，星期天52实例：尿激酶（urokinase）

本品系从新鲜人尿中提取的一种激活纤维蛋白溶酶原的酶。由高分子量54000和低分子量33000组成的混合物，高分子量含量不得少于90%，每1mg蛋白中尿激酶活力不得少于12万U，蛋白分解药物。第52页,共58页，2024年2月25日，星期天53尿激酶（一）性状本品为白色非结晶状粉末（二）鉴别取比活力测定项下的供试品溶液，用巴比妥-氯化钠缓冲液（pH7.8）稀释成每1ml中含20U的溶液，吸取1ml，加纤维蛋白原溶液0.3ml，再依次加入纤维蛋白溶酶原溶液0.2ml，凝血酶溶液0.2ml，迅速摇匀，立即置37±0.5℃恒温水浴中保温，记时，反应系统应在30～45s内凝结，且凝块在15min内重新溶解。以0.9%氯化钠溶液作空白，同法操作，凝块在2h内不溶。第53页,共58页，2024年2月25日，星期天54（三）检查

1．溶液的澄清度与颜色，

应澄清无色。2．分子组分比

取本品，加水制成每1ml中含2mg的溶液后，加入等体积的缓冲液（取浓缩胶缓冲液2.5ml，20%十二烷基磺酸钠溶液2.5ml，20%十二烷基磺酸钠溶液的10ml），置水浴中3min，放冷，作为供试品溶液；取供试品溶液10μl，加至样品孔，照电泳法测定，按下式计算高分子尿激酶相对含量（%）。第54页,共58页，2024年2月25日，星期天55（三）检查3．干燥失重

取