精减4重组-13硕课件

17四月2024精减4重组-13硕DNA重组（DNArecombination）DNA分子内或分子间发生遗传信息的重新组合，即核苷酸序列的交换、重排(rearrangement)和转移现象，称为DNA重组。重组产物称为重组体DNA。4/17/20242DNA重组的广泛性广泛存在于各类生物真核生物基因组间重组多发生在减数分裂时同源染色体之间的交换。细菌及噬菌体来自不同亲代两组DNA之间可通过多种形式进行遗传重组。4/17/202434/17/20244DNA重组的生物学意义迅速增加群体的遗传多样性通过优化组合积累有意义的遗传信息参与许多重要的生物学过程

为DNA损伤或复制障碍提供修复机制---重组修复某些生物的基因表达受DNA重组调节4/17/20245DNA重组在相应序列之间精确发生，在重组染色体上既不多加也不丢失任何碱基。重组可分为三种类型，其共同点是在两个DNA双链之间发生物理性物质交换。不同类型发生的机制不同。DNA重组的特点4/17/20246DNA重组机制一、同源重组(homologousrecombination)二、位点特异性（专一性）重组(site-specificrecombination)三、转座重组(transpositionrecombination)4/17/20247一、同源重组(homologousrecombination)一般性重组(generalrecombination)是在两个DNA分子的同源序列间直接进行交换的一种重组形式。真核生物中，同源重组发生在减数分裂时期细菌的转化、接合、转导4/17/20248一、同源重组1Holliday模型RobinHolliday于1964年提出2大肠杆菌同源重组的分子基础4/17/202491Holliday模型Branchmigration异源双链区分支迁移Holliday连接重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本，称为片段重组体。重组体含有一段异源双链区，其两侧来自不同亲本，称为拼接重组体。4/17/202410Holliday模型形成小结1重组始于双链断裂与再连接（两条同源序列先整齐排列）两个配对双链DNA的同源链中相应位点发生断裂2通过分支迁移产生异源双链重组结合点能够沿双链移动3形成Holliday中间体4Holliday中间体切开并修复，切口方向决定重组结果片段重组体（前后两个切口在同一条链上）拼接重组体（前后两个切口在不同链上）4/17/202411DNA在分支点形成带有一些单链十字形Holliday中间体PotterDressler噬菌体4/17/202412同源重组双链之间进行连接所需要的同源区域最短是多少？

通过质粒及噬菌体把短的同源序列引入细菌的实验表明，如果同源区小于75bp则重组频率降低。

4/17/2024132大肠杆菌同源重组的分子基础在细菌中识别重组位点重组仅涉及DNA分子的限定区域而不是完整的染色体重组的一般过程是相同的：1）两条序列先平行排列，然后两条序列的其中一条单链均发生断裂2）断裂分子的一个单链与其同源双链相互作用3）配对区域延伸-----分支迁移4）内切核酸酶消化同源双链4/17/2024142大肠杆菌重组的分子基础每一步都需要酶的催化重组（Recombination）有关的酶RecA蛋白与RecBCD系统RuvA、RuvB和RuvC蛋白4/17/202415RecA蛋白及其功能在E.coli中，RecA蛋白参与重组是最关键的步骤1诱发SOS反应

－－作为共蛋白酶(co-protease)促进LexA蛋白的水解；是SOS反应最初发动的因子2促进DNA单链的同化

单链同化即指单链与同源双链分子发生链交换，从而产生重组过程中的DNA配对、Holliday中间体形成、分支迁移等步骤。4/17/202416

严重的DNA损伤产生大量单链缺口

LexA阻遏蛋白裂解，阻遏作用解除

激活RecA蛋白（需要单链DNA和ATP存在）

一系列基因表达（包括修复基因）

DNASOS修复（易错修复，突变增加）RecA蛋白诱发SOS反应4/17/202417

E.coli的SOS反应

4/17/202418重组修复损伤ABCD序列相同重组4/17/202419RecA蛋白介导的DNA链交换模型（单链同化）RecA蛋白与单链DNA结合复合物与同源双链DNA结合入侵单链与双链中的互补链配对，同源链被置换RecA蛋白与单链DNA的结合具有协同性4/17/202420RecBCD系统及其功能1任何部位的单链DNA都能借助RecA蛋白与同源双链DNA进行链交换。2单链DNA可由多种途径产生。3RecBCD酶是产生参与重组的DNA单链的主要途径，产生3’单链末端。该酶的亚基分别由基因recB、recC和recD编码。4/17/202421RecBCD系统及其功能具有三种酶的活性1依赖于ATP的核酸外切酶活性2可被ATP增强的核酸内切酶活性3ATP依赖的解螺旋酶活性4/17/202422产生3’单链DNAΧ序列4/17/202423Χ序列及其功能是一段特殊的碱基序列，其一致序列是5’-GCTGGTGG它的存在能显著提高重组的频率能在重组过程中调节RecBCD的酶活性作为其从3’-5’外切酶活性转变为5’-3’外切酶活性的信号4/17/202424RuvA、RuvB和RuvC蛋白RuvA蛋白识别Holliday连接，协助RuvB蛋白催化分支的迁移。以一种特别的方式形成四聚体，呈四重对称。RuvB蛋白是一种解链酶，催化重组中分支的迁移，是一种环状六聚体蛋白。单独结合DNA的效率并不高，需要RuvA的帮助。RuvC蛋白是一种特殊的核酸内切酶，在重组中促进Holliday连接的分离，又称拆分酶，是一种二聚体蛋白。其作用具有一定的序列特异性，其作用的一致序列为5’-(A/T)TT(G/C)-3’4/17/202425识别连接分支迁移连接分离4/17/202426产生3’单链4/17/202427二、位点专一性重组(site-specificrecombination)指发生在DNA特异性位点上的重组参与重组的特异性位点需要专门的蛋白质识别和结合4/17/202428二、特异位点重组（位点专一性重组）λ噬菌体在E.coli细胞中以两种形式存在：裂解状态与溶原状态（前噬菌体）两种类型间的转换通过位点特异性重组实现为了进入溶原状态，游离λDNA必须整合到宿主DNA中(整合反应)；为了从溶原状态进入裂解周期，前噬菌体DNA必须从染色体DNA上切除下来(切除反应)。4/17/202429（一）λDNA通过位点特异性重组机制整合和切除1重组反应在附着位点(attachmentsite)发生2与催化有关的酶类4/17/202430（一）λDNA通过位点特异性重组机制整合和切除1重组反应在附着位点(attachmentsite)发生整合和切除过程是在细菌和噬菌体DNA上被称为附着位点的特殊位置上，通过重组作用而实现。4/17/202431（一）λDNA通过位点特异性重组机制整合和切除1重组反应在附着位点(attachmentsite)发生在细菌遗传学中，细菌染色体上的这一附着位点称为attλ。若这一座位发生突变，则会抑制λ的整合。细菌上的附着位点（attλ）称为attB(Bacteria)，噬菌体上的称为attP(Phage)attP长度为255bpattB长度为30bp两者含有共同的核心序列15bp（O区）POP’BOB’4/17/202432（一）λDNA通过位点特异性重组机制整合和切除1重组反应在附着位点(attachmentsite)发生2与催化重组有关的酶类4/17/202433（一）λDNA通过位点特异性重组机制整合和切除2催化重组的酶类

整合反应：整合酶（Integrase,Int）、整合宿主因子（IntegrationHostFactor,IHF）

切除反应：整合酶（Int）、整合宿主因子（IHF）、噬菌体基因xis产物4/17/202434切除反应整合反应xis噬菌体BB‘环形噬菌体DNA通过attP位点和attB位点的交互重组将噬菌体DNA变成整合的线形前噬菌体DNA整合integration4/17/2024354/17/202436attP(255bp)attB(30bp)attO(15bp)4/17/202437（二）位点特异性重组结果依赖于重组

位点的位置和方向12211212212结果发生倒位结果发生切除切除的环形片段重组位点反方向位于同一DNA分子上重组位点同方向位于同一DNA分子上14/17/202438位点特异性重组结果小结1当重组位点反方向位于同一DNA分子上时，重组结果：发生倒位；2当重组位点同方向位于同一DNA分子上时，重组结果：发生切除；3当重组位点位于不同DNA分子上时，重组结果：发生整合。4/17/202439（三）细菌的特异位点重组沙门菌的H抗原H1鞭毛蛋白H2鞭毛蛋白单菌落的沙门菌中经常出现少数呈另一H抗原的细菌细胞（鞭毛相转变）4/17/202440沙门菌的H片段倒位遗传学分析表明，这种抗原相位改变是由一段995bp的DNA，称为H片段发生倒位所决定的。4/17/202441hin编码特异的重组酶（倒位酶）hix为14bp的反向重复序列重组位点Promoterhin是否仍表达？H2、rH1呢？H1呢？沙门菌H片段倒位决定鞭毛相转变4/17/202442沙门菌的H片段倒位遗传学分析表明，这种抗原相位改变是由一段995bp的DNA，称为H片段发生倒位所决定的。rH1阻遏蛋白与启动子结合阻止H1表达PH片段（995bp）PH片段（995bp）为14bp的反向重复序列hixhin编码特异的重组酶（倒位酶）4/17/202443沙门氏菌的H片段倒位rH1倒位后，启动子序列与H2、rH1取向相反，H2、rH1不表达,解除了对H1的抑制，H1表达PPH1鞭毛素H片段（995bp）hin是否仍表达？√4/17/202444三、转座重组(transpositionrecombination)指DNA上的核苷酸序列从一个位置转移到另外一个位置的现象。发生转位的DNA片段称为转座元件、可移位遗传元件(mobilegeneticelement,MGE)、跳跃基因(jumpgene)4/17/202445转座元件的种类

原核生物转座元件的种类

IS（插入序列）TnAfamilyCompositetransposonTransposablephage

复制型转座元件(replicatingtransposableelement)

4/17/202446长度较小，一般700－2000bp之间两端通常含有10－40bp长的IR(invertedrepeats)内部一般只有一个基因，编码产物为转座酶缺乏抗生素或其他毒性抗性基因(一)插入序列（insertionsequence，IS）l

7002000basepair（bp）GATCGTC--------------------------GACGATCCTAGCAG---------------------------CTGCTAG●GATCGTC--------------------------GACGATC

Stem-loop

5’

GATCGTC3’CTAGCAG

4/17/202447IS的结构一个结构基因反向重复序列4/17/202448IS的转座机制

当IS转座时，宿主靶部位双链交错切开，经修复后IS两侧形成短的正向重复。4/17/202449基因的表达及其产物的活性?ATGTAAATGTAA4/17/202450(二)转座子(Transposon，Tn/TnpAfamily)

l两侧含有35－40bp的IRl

较长，2.5kb20kb

l内部通常含有不止一个结构基因：转座酶基因、调节基因、抗生素抗性基因(resistancegene)

4/17/202451l

Tn1(AmpR)Tn2(AmpR)Tn3(AmpR)Tn4(AmpRStrR)Tn5(KanR)Tn6(kanR)Tn7(StrRTmpR)Tn9(CamR)Tn10(TetR)多个结构基因反向重复序列4/17/202452(三)复合元件/复合转座子

（compositeelement/compositetansposon）●

IS插入到一段带有抗生素抗性基因或其它毒性抗性基因等结构基因的两端，形成复合转座子。IStranspositionmutationISIS

ISLISR臂中心区臂插入结果？4/17/202453●复合转座子一旦形成，转座功能受较多因子调控●结构特点

IRIRIRIRIRIR

IS10LTn10(9.3kb)IS10R

IRIRIRIRDRDR

IS1LTn9(2.5kb)IS1R结构基因两端IS序列方向相反结构基因两端IS序列方向相同两种转座子的稳定性？4/17/202454●稳定性发生切除DR型(Instable)4/17/202455IR型(Stable)InversionBAABBA发生倒位4/17/202456思考题：转座子Tn9和Tn10，哪一种较稳定？为什么？4/17/202457转座重组产生的效应1.是基因突变和重排的重要原因：转座元件的存在，会增加宿主基因组DNA的量，同时引起宿主染色体DNA重组，造成染色体断裂、重复、缺失、倒位及易位等。2.影响邻近基因的表达，改变宿主表型：转座元件也可通过干扰宿主基因与其调控元件之间的关系或转座元件本身的作用而从而改变宿主表型。4/17/202458转座重组产生的效应转座元件插入特定基因内部后，很可能导致基因失活，这是转座作用最直接的效应。当转座元件自发插入细菌的启动子时，即可阻止它所控制基因的转录和翻译。由于转座元件带有终止子，其插入将影响操纵子中其后基因的表达。4