3.2基因工程的基本操作程序课件高二下学期生物人教版选择性必修33

第3章

第2节、基因工程的基本操作程序目录CONTENTS一二第一步：目的基因的筛选与获取三第四步：目的基因的检测和鉴定第二步：基因表达载体的构建第三步：将目的基因导入到受体细胞四从社会中来

我国自上世纪80年代起就使用菊酯类农药杀灭棉铃虫。但到了1992年，棉铃虫产生了极强的耐药性，可以在农药中游泳，鸡吃虫却被毒死，从过量撒药到人工捉虫，传统手段已经对棉铃虫束手无策，不仅农民收成全无，还产生了大量农药中毒的例子，这时候我们把目光转向了新型的生物技术--转基因抗虫棉。

1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。思考：1.转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗?通过实验将细菌的“杀虫基因”转到棉花里，产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白(Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。P77转基因抗虫棉（使棉铃虫死亡，左）与非转基因抗虫棉（右）苏云金杆菌与载体拼接

普通棉花（无抗虫特性）棉花细胞抗虫棉提取表达Bt基因导入Bt基因重组DNA分子培育转基因抗虫棉的简要过程1.目的基因的筛选与获取2.基因表达载体的构建3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的

检测与鉴定培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。主要指的是编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。1.目的基因2.目的基因的筛选方法（1）从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。（较为有效的方法）如科学家知道苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关并掌握了Bt基因的序列信息；Bt抗虫蛋白只在某类昆虫肠道的碱性环境中才表现出毒性，对人和牲畜无影响。（2）利用测序技术、序列数据库（如GenBank）、序列对比工具（如BLAST）等，找到合适的目的基因。

利用PCR(聚合酶链式反应)扩增目的基因（常用）阅读P77，获取PCR的定义、条件、大致过程。3.目的基因的获取一、目的基因的筛选与获取解旋酶DNA聚合酶母链(模板链)子链(新合成的链)四种脱氧核苷酸3’3’5’3’5’5’3’5’回顾：体内DNA复制(2)条件:4种游离的脱氧核苷酸DNA的两条链DNA解旋酶、DNA聚合酶等ATP(3)复制原则:碱基互补配对原则（A与T、C与G配对保证复制的准确进行）能量：模板：原料：酶：半保留复制、边解旋边复制(1)特点:CCGTAGTATACGGCTAGCCGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATA3'5'ACGCAAGCTAGTCATTATATGCATGATCGAGCTTACGCAAGCTAGTCATTADNA聚合酶5'3'TATGCATGATCGAGCTT5'3'ATPDNA聚合酶作用下形成磷酸二酯键子链延伸合成的方向？只能从5′－端→3′－端延伸，细胞内有RNA引物结合到模板3′－端引发子链的延伸015'端到3'端ATP1.原理：DNA半保留复制2.条件：模板（目的基因）、2种引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、缓冲溶液（含Mg2+)3.过程：耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）4种脱氧核苷酸（dNTP）引物待扩增的DNA片段（模板）5’5’变性复性延伸温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶PCR（聚合酶链式反应）1）变性（不需要解旋酶）：当温度上升到_______以上时，

断裂，双链DNA解聚为两条

。

氢键单链DNA待扩增的DNA片段第一步：变性3’3’5’5’3’5’3’5’变性90℃思考：变性的温度为何是90℃以上的一个温度范围，而不是95℃？因为变性的温度与氢键的数量有关。当氢键数量越多时，所需温度就越高；反之，当氢键数量越少时，所需温度也就越低。PCR反应的过程012）复性：当温度下降到50℃左右时，两种引物通过

与两条单链DNA结合。

第二步：复性引物1引物2DNA引物3’5’3’5’碱基互补配对5’5’思考：为什么需要引物？引物结合在模板链的什么位置？①因为Taq酶不能从0开始添加核苷酸。②引物结合在DNA模板链

3'端位置，引导子链从5'端→3'端方向复制。3’3’PCR反应的过程013）延伸：当温度上升到______左右时，溶液中的4种____________在耐高温的____________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。

第三步：延伸引物1引物2Taq酶Taq酶3’5’3’5’脱氧核苷酸5’5’DNA聚合酶72℃3’3’3’3’思考1：为什么温度要上升至72℃？思考2：Taq酶结合在引物的3’还是5’端？72℃是Taq酶的最适温度Taq酶结合在引物的3’端PCR反应的过程01要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？要在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列4.优点：可以在短时间内大量扩增目的基因

由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。

即成指数形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。PCR（聚合酶链式反应）5’3’5’5’第一次循环第二次循环3’5’第三次循环3’3’问题探究：（1）PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因（开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段）？（2）如果循环n次，则共需消耗

个引物。

则共需消耗

对引物。2n+1－22n－1PCR技术与DNA复制过程比较PCR技术DNA复制相同点原则原料条件不同点解旋方式场所酶结果碱基互补配对四种脱氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高温下变性解旋解旋酶催化体外复制细胞内（主要在细胞核内）耐高温的DNA聚合酶解旋酶、DNA聚合酶大量的DNA片段形成整个DNA分子思考·讨论(1)PCR扩增的是完整的模板DNA分子吗？不是，PCR扩增的仅仅是两种引物之间所对应的特定DNA片段。(2)经过第几轮扩增后，循环产物中出现位于两种引物之间的DNA片段？

比例是多少？31/4(3)如果已知某目的基因的序列和结构，利用PCR筛选和扩增出该目的基因的关键是什么？以指数方式扩增，即2n（n为扩增循环的次数）根据目的基因两端的核苷酸序列设计引物。补充——引物设计原则P77：1.长度适当（20-30bp）；2.引物内部不发生碱基互补配对；3.引物之间不发生碱基互补配对；4.GC含量适宜。知识回顾（1）PCR的概念:PCR是__________________的缩写，是一项根据__________________的原理，在______提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对________________________进行__________的技术。聚合酶链式反应体外目的基因的脱氧核苷酸序列大量复制DNA半保留复制（2）扩增过程:

目的基因DNA___________后解为单链，_____与单链相应互补序列结合；然后以__________为模板在______________作用下进行______，即将4种____________加到_____________，如此重复循环多次。受热变性引物延伸单链DNADNA聚合酶引物的3’端脱氧核苷酸每次循环一般可以分为_______、_____、_____三步。变性复性延伸4种脱氧核苷酸【实际上是4种dNTP（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）】，既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量引物既可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般为RNA片段；PCR引物一般为DNA片段。P79·用PCR可以扩增mRNA吗？mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。cDNA【课堂练习】设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。(1）第1组：

；

第2组：

。引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效引物Ⅰ′自身内部部分碱基发生互补配对而失效（2）在DNA聚合酶的作用下，两条子链的延伸方向都是

。DNA聚合酶只能特异地复制处于

之间的DNA序列，若这个过程中消耗了引物62个,则进行了

轮的DNA复制。（3）若用PCR技术扩增图示目的基因，应选用的引物是

。两个引物从子链的5′端向3′端延伸5引物甲、引物丙62个引物=形成62条新单链=31个新DNA，加上原有的模板DNA，现在一共有32个DNA，即复制5次的结果。PCR中的数量关系①n代后，DNA分子有_____个；②n代后，DNA链有_____条；③第____代出现完整的目的基因；④n代后，含引物的DNA分子有_____个；⑤n代后，含其中一种引物的DNA数________；⑥n代后，两条脱氧核苷酸等长的DNA数_______。第1代第2代第3代第4代2n2n+132n2n-12n-2n解析：等长目的基因=总DNA数-不等长的不等长的=（长链·中链）+（中链·短链）

中链数每次循环增加两个，共2n个（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；（2）使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因+复制原点二、基因表达载体的构建（基因工程的核心）1.基因表达载体的目的2.基因表达载体的组成（1）启动子：（2）终止子：（3）标记基因：（4）复制原点：一段有特殊序列结构的DNA片段；①本质：②位置：位于基因的上游，紧挨转录的起始位点；③功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。一段有特殊序列结构的DNA片段；①本质：②位置：位于基因的下游；③功能：使转录在所需要的地方停下来作用：便于重组DNA分子的筛选DNA复制开始的地方，使能完成自主复制二、基因表达载体的构建（基因工程的核心）2.基因表达载体的组成启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比项目启动子终止子起始密码子终止密码子本质_________________________位置目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端功能_________________________________________________________________________________________________________________________DNADNAmRNAmRNARNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA使转录在所需要的地方停下来翻译的起始信号(编码氨基酸)翻译的结束信号(不编码氨基酸)载体（质粒）DNA分子（含目的基因）限制酶处理带有黏性末端或平末端的切口带有相同黏性末端或平末端的目的基因片段DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种载体基因表达载体二、基因表达载体的构建（基因工程的核心）3.基因表达载体的构建过程（1）原核生物基因非编码区非编码区启动子：RNA聚合酶的识别和结合位点开始转录编码区终止子：终止转录基因的结构编码区：能转录相应的mRNA，进一步编码（翻译）出蛋白质的DNA区段非编码区组成：编码区上游与编码区下游功能：不能编码蛋白质，调控遗传信息的表达（2）真核生物基因P80旁栏思考：将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便么？如果这样做，效果会怎样？这种方法针对性差，完全靠运气也无法确定哪些基因导入了受体植物。思考·讨论使用一种DNA限制酶进行切割，是否只会得到目的基因与载体结合的这一种重组DNA？载体目的基因自连片段间的连接目的基因自连质粒自连目的基因与质粒连接目的基因与目的基因连接质粒与质粒连接正向连接反向连接11’22’122’1’22’1’1选择两种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割，防止目的基因和载体的自身环化和反向连接。A.用限制酶HindⅢ和PstⅠ切割质粒，可得到2条DNA片段B.不能用AluⅠ酶切割质粒和外源DNA的原因是AluⅠ酶会破坏目的基因C.构建重组DNA时，需选择SmaⅠ酶和PstⅠ酶同时切割质粒和外源DNAD.导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长而不能在含氯霉素的

培养基上生长√4.(2023·江苏苏州高二期末)某科研小组利用质粒(图甲)和目的基因(图乙)构建重组DNA。下列分析不正确的是将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法花粉管通道法——显微注射法——Ca2+处理法我国科学家独创（常用）三、将目的基因导入受体细胞（1）花粉管通道法（我国科学家独创）①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；②在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。花粉管通道法导入外源DNA三、将目的基因导入受体细胞1.将目的基因导入植物细胞（2）农杆菌转化法①转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。②特点：a.能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。b.农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。三、将目的基因导入受体细胞1.将目的基因导入植物细胞导入三、将目的基因导入受体细胞1.将目的基因导入植物细胞（2）农杆菌转化法③过程：两次拼接和两次导入a.两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的

上；第二次拼接（非人工操作）指被插入目的基因的T­DNA拼接到受体细胞

上。b.两次导入：第一次导入是将含目的基因的重组Ti质粒导入

；

第二次导入（非人工操作）是指含目的基因的

导入受体细胞。T-DNA染色体DNAT-DNA农杆菌1.农杆菌转化法中，目的基因是否就是T-DNA，如果不是，T-DNA与目的基因是什么关系？T-DNA不是目的基因，但它将来会被整合到宿主细胞染色体的DNA上，只要将目的基因插入T-DNA中，目的基因就可以随T-DNA进入宿主细胞并整合到宿主细胞的染色体上。2.农杆菌转化法中，目的基因只能进入植物的一个体细胞，但基因工程最终要的是一个转基因植株，如何实现这一目标？得到含有目的基因的植物细胞后进行植物组织培养问题探讨三、将目的基因导入受体细胞2.将目的基因导入动物细胞（1）导入方法：（2）受体细胞:显微注射法受精卵原因：①体积大，易操作；

②易表现出全能性。（3）过程：构建基因表达载体并提纯利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中早期胚胎培养胚胎移植获得具有新性状的动物三、将目的基因导入受体细胞3.将目的基因导入微生物细胞（1）常用方法：Ca2+处理原核细胞（常选择大肠杆菌）可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。（3）过程：（目的？）（2）受体细胞：（优点？）繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少，易于培养。Ca2+处理细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收重组DNA增加细胞壁的通透性一般利用温度变化导入将目的基因导入受体细胞的方法总结细胞种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法显微注射Ca2＋处理法(CaCl2)受体细胞受精卵或体细胞受精卵常用原核细胞转化过程目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA中→表达目的基因表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2+处理细胞→能吸收周围环境中DNA分子的生理状态细胞→重组的基因表达载体导入细胞中四、目的基因的检测与鉴定

目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。1.检测与鉴定的方法分子水平的检测个体水平的鉴定四、目的基因的检测与鉴定（1）分子水平的检测①电泳检测法方法2：可以以质粒为模板进行PCR扩增，之后再进行电泳检测。设计PCR的一对引物时，最好一个引物与质粒DNA互补结合，另一个引物与目的基因DNA互补结合，这样只有以重组DNA为模板才能获得扩增产物（也可以都跟目的基因互补结合，这样只有含有目的基因，才能获得扩增产物），之后再进行电泳检测；方法1：体细胞中的质粒直接进行电泳检测或者选择合适的限制酶对质粒进行酶切后再进行电泳检测，同时可借助指示分子大小的标准参照物来进一步确认目的基因。方法3：提取受体细胞的mRNA，进行逆转录，获得cDNA，用上述方法2进行PCR扩增，之后再进行电泳检测；重组质粒四、目的基因的检测与鉴定（1）分子水平的检测②核酸杂交检测法（原理）

在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA或mRNA杂交（遵循碱基互补配对原则），若出现杂交带，则目的基因插入成功或转录出mRNA。四、目的基因的检测与鉴定（1）分子水平的检测③抗原-抗体杂交技术在抗原-抗体杂交中，目的蛋白是作为抗原还是抗体？

从转基因棉花中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原-抗体杂交，若出现杂交带，则目的基因成功翻译出蛋白质。抗原苏云金芽孢杆菌提取Bt毒蛋白注射小鼠体内抗体标记抗体提取蛋白电泳分离抗原抗体杂交脱分化四、目的基因的检测与鉴定（2）个体水平的检测转基因生物检测方法观察目标抗虫植物害虫吞食害虫是否死亡抗病植物病毒(菌)感染是否出现病斑抗盐植物盐水浇灌是否正常生长抗除草剂植物喷洒除草剂是否正常生长获取目的基因产物的转基因生物提取细胞产物，与天然产品进行功能活性比较细胞产物的功能活性是否正常1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。（1）afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。（

）（2）构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶。（

）（3）只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功。（

）√××练习与应用(P83)2.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述

错误的是（

）A.PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶B.变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶C.复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则D.延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和4种核糖核苷酸D一、概念检测研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时，发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律，在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。请查找相关资料，尝试对这个问题作出解释。二、拓展应用外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如，科研人员在对转GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。探究·实践

DNA片段的扩增及电泳鉴定1.PCR在体外进行DNA片段的扩增原理：DNA的热变性原理;DNA半保留复制的原理。2.DNA片段的扩增过程：移液用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分

离心待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）反应参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。循环程序变性复性延伸预变性94℃,5min//30次94℃,30s55℃,30s72℃,1min最后一次94℃,1min55℃,30s72℃,1min可根据目的片段长度适当调整延伸时间预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。(4)如何对PCR产物进行鉴定？琼脂糖凝胶电泳P84必修二P52DNA片段电泳鉴定的原理DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构像等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外