高三一轮复习生物基因工程的基本工具和操作过程课件

生物一轮复习第十三单元

基因工程第1讲

基因工程的基本工具和操作过程考点1基因工程的基本工具考点2基因工程的基本操作程序一、基因工程的概念(1)手段：按照___________，通过________等技术，赋予生物新的遗传特性。

(2)目的/结果：创造出更符合人们需要的新的_________和__________。(3)水平：___________水平。(4)基础：________、分子生物学和

等学科。(5)原理:

。(6)操作环境:生物

（体内/体外）进行(7)优点：

、

。

人们的愿望转基因生物类型生物产品DNA分子生物化学微生物学

定向改造生物性状（目的性强）基因重组克服远缘杂交不亲和的障碍体外1基因工程的基本工具“分子手术刀”“分子缝合针”“分子运输车”二、基因工程的基本工具1、分子手术刀——

。限制性内切核酸酶

特定核苷酸序列数千原核生物磷酸二酯键大多数是6个核苷酸

限制酶

一种限制酶只能识别一种脱氧核苷酸序列黏性末端酶的专一性大本P325(情景探究)如图表示目的基因两侧和载体上的限制酶切割位点，据图分析：(1)如图选择限制酶时，选择Pst

Ⅰ，而不选择Sma

Ⅰ的原因是什么？选择限制酶时，不能破坏目的基因或标记基因(2)为了避免目的基因和质粒自身环化、反向连接，应该如何选择限制酶？选择Pst

Ⅰ和EcoR

Ⅰ两种限制酶。(3)切割目的基因和质粒的限制酶是否一定为同一种限制酶？不一定，只要切出的黏性末端相同即可。①一个基因从DNA分子上切下来，需要切

处，产生

个黏性末端，断

个磷酸二酯键，需要

个水。

②选择限制酶切割位点的基本原则：A.切割目的基因时：

。B.切割质粒时：

。【突破】用限制酶切割时需注意的事项2444能切下目的基因且不破坏目的基因至少保留一个完整的标记基因，便于筛选磷酸二酯键大肠杆菌黏性末端黏性末端2、分子缝合针——

。但连接平末端效率较低

DNA连接酶1、与DNA有关的几种酶的比较DNA聚合酶作用需要模板，

而DNA连接酶不需要大本P325质粒(常用）、噬菌体、动植物病毒①将目的基因送入受体细胞②在受体细胞内对目的基因进行大量复制

载体3、分子运输车——

。

种类：

作用：条件①有一个至多个限制酶切割位点③对受体细胞无害④能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA

同步复制。②具有标记基因✭真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。(1)质粒与拟核中的DNA有哪些相同点：（至少写出两点）

①

。

②

。

③

。(2)质粒

（是/不是）一种细胞器。(3)细胞膜上的载体蛋白与基因工程中的载体的区别①化学本质不同：细胞膜上的载体：

。基因工程中的载体可能是物质，如

；也可是生物，如

；

②功能不同：细胞膜上的载体功能

;基因工程中的载体是一种“分子运输车”,把

。化学本质和结构相同能够自我复制具有遗传效应或都能够指导蛋白质的合成等不是蛋白质质粒动植物病毒、噬菌体协助细胞膜控制物质进出细胞目的基因导入受体细胞【比较】易错点拨大本P325

1．(选择性必修3P74“拓展应用1”)限制酶为什么不切割细菌本身的DNA分子？原核生物中存在限制酶的意义是什么？

2．(选择性必修3P74“正文信息拓展”)天然的DNA分子是否可以直接用做基因工程载体？为什么？本身DNA不具备限制酶的识别序列，

具有限制酶的识别序列但已被甲基化，不能被切开

切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原物的危害。不可以。

基因工程的载体应具有①能自我复制；②有一个或多个限制酶切割位点；③有标记基因；④对受体细胞无害等特点，实际上天然的DNA分子一般不完全具备上述条件，往往需要进行人工改造后才能用于基因工程操作。思考：人的胰岛素基因为何能拼接到大肠杆菌的DNA中，并在大肠杆菌中表达？大本P3255．(不定项)(2020·山东高考)下图表示甲、乙两种单基因遗传病的家系图和各家庭成员基因检测的结果。检测过程中用限制酶处理相关基因得到大小不同的片段后进行电泳，电泳结果中的条带表示检出的特定长度的酶切片段，数字表示碱基对的数目。下列说法正确的是(

)A．甲病的致病基因位于常染色体上，乙病的致病基因位于X染色体上B．甲病可能由正常基因发生碱基对的替换导致，替换后的序列可被Mst

Ⅱ识别C．乙病可能由正常基因上的两个BamHⅠ识别序列之间发生碱基对的缺失导致D．Ⅱ4不携带致病基因、Ⅱ8带致病基因，两者均不患待测遗传病CD限制酶DNA连接酶载体①具有标记基因；②具有一个至多个限制酶切割位点；③能在受体细胞中进行自我复制④对受体细胞无害、易分离质粒、噬菌体、动植物病毒基因工程的基本工具作为载体的条件种类：磷酸二酯键来源：主要来源于原核生物作用部位：结果：形成黏性末端或平末端连接部位：磷酸二酯键种类：E.coliDNA连接酶、T4DNA连接酶作用：把两条双链DNA片段拼接起来

小

结2基因工程的基本操作程序目的基因的筛选与获取（前提）基因表达载体的构建（核心）将目的基因导入受体细胞（关键）目的基因的检测与鉴定（保证）一、目的基因的筛选和获取1、目的基因：主要指___________的基因，也可以是一些具有_____作用的因子。编码蛋白质调控教材P76大本P3262、目的基因的筛选（1）

较为有效的方法之一从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。（2）辅助工具

随着测序技术的发展，以及序列数据库（GenBank）、序列比对工具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体。（3）实例：Bt抗虫蛋白基因（Bt基因）的筛选过程苏云金杆菌（Bt）制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害对Bt基因的表达产物-Bt抗虫蛋白有较为深入的了解：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关掌握了Bt基因的序列信息Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因Bt抗虫蛋白的抗虫原理：当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。思考：Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？大本P3283、获取目的基因的方法（2）从_________中获取从____________中获取从部分基因文库(如cDNA文库)中获取基因文库基因组文库（1）用_____方法直接人工合成条件：基因比较小，

已知方法：通过___________用化学方法直接人工合成化学核苷酸序列DNA合成仪含有一种生物所有基因的文库只含有一种生物部分基因的文库基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。构建cDNA文库的方法：首先得到mRNA，再逆转录得cDNA，形成文库。cDNA文库与基因组文库的区别在于cDNA文库在mRNA拼接过程中已经除去了内含子等成分，便于DNA重组时直接使用。（3）利用PCR技术扩增目的基因①概念：PCR全称为

，是一项在生物

复制特定DNA片段核酸合成技术聚合酶链式反应②原理：

。

③条件：DNA半保留复制DNA模板、2种引物、耐高温的DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸。引物相关考点：本质：一小段

；作用：两种引物的要求：使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸DNA或RNA单链需要Mg2＋激活改变G……dGTPC……dCTPT……dTTP实际加入的为dNTP，既可作为原料，又可提供能量。ⅰ引物自身不能环化ⅱ两种引物之间不能互补配对ⅲ引物长度不宜过短，防止引物随机结合体外01耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）4种脱氧核苷酸（DNTP）引物待扩增的DNA片段（模板）5’5’变性复性延伸温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。④PCR的基本步骤PCR技术和DNA复制的比较2.PCR可以扩增mRNA吗？大本P328不可以，因为PCR是用来扩增DNA片段的，不能直接用单链RNA做PCR，必须把mRNA逆转录成单链cDNA之后再做PCR。5’3’5’5’第一次循环第二次循环3’5’第三次循环3’3’思考：PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因？①n代后，DNA分子有_____个②n代后，DNA链有_____条③第____代出现完整的目的基因④n代后，含引物的DNA分子有_____个⑤n代后，共消耗_____

个引物⑥第n代复制，消耗了______个引物2n2n+132n2n+1-22n第一代第二代第三代第四代第五代PCR技术小结1．PCR是一种体外扩增DNA的技术，模拟了体内的DNA复制过程。如图为PCR技术原理示意图，对于图中物质和过程的说明，错误的是(

)A．物质a：游离的脱氧核苷酸B．过程①：氢键断裂C．过程②：边解旋边复制D．过程③：严格遵循碱基互补配对原则大本P329C大本P3303．(不定项)不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA的方法。这两种引物分别为限制性引物与非限制性引物，其最佳比例一般为1：50－1：100，在PCR反应的最初10－15个循环中，其扩增产物最初主要是双链DNA，但当限制性引物消耗完后，非限制性引物引导的PCR就会产生大量的单链DNA。下列相关说法错误的是(

)A．不能利用不对称PCR来制备探针B．复性温度过高可能导致PCR反应得不到任何扩增产物C．用不对称PCR方法扩增目的基因时需知道基因的全部序列D．因为双链DNA和单链DNA的分子量大小不同，可通过电泳方法将其分离AC思考：能不能直接将目的基因导入受体细胞，为什么？如果不能，如何避免该结果的发生呢？游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，且游离的DNA片段不能稳定遗传。构建基因表达载体（核心步骤）①

;②

。二.基因表达载体的构建——核心步骤启动子：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动转录。终止子：终止转录1、目的使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代使目的基因能够表达和发挥作用2、组成标记基因：目的基因：复制原点：鉴别或筛选含有目的基因的受体细胞目的基因必须插到

与

之间。终止子DNA复制的起始位点。启动子基因上游位置：作用：基因下游位置：作用：巩固练习项目启动子终止子起始密码子终止密码子本质_________________________位置目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端功能_________________________________________________________________________________________________________________________DNADNAmRNAmRNARNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA（启动转录）使转录在所需要的地方停下来（终止转录）翻译的起始信号(编码氨基酸)翻译的结束信号(不编码氨基酸)启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比重组DNA分子限制酶目的基因限制酶切割位点获取目的基因DNA连接酶限制酶同种限制酶或能产生相同末端的限制酶基因表达载体3、基因表达载体的构建过程使用一种限制酶进行切割Bt基因和pBI121质粒，共有几种连接情况？请大家尝试用胶带模拟DNA连接酶进行操作。探究‧活动载体与目的基因反向连接载体与目的基因正向连接目的基因与目的基因之间的连接目的基因自身环化载体自身环化载体与载体之间的连接思考讨论单酶切缺点:质粒和目的基因自身环化质粒与目的基因反向连接问题探讨选择两种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割-G-CTTAA-A-TCTAG-G-CTTAA如何防止目的基因和质粒的自身环化以及目的基因的反向连接？思考讨论1、限制酶的选择原则①不破坏目的基因；②至少保留一个标记基因③确保出现相同黏性末端：(为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，常使用不同的限制酶切割目的基因和质粒)设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ大本P3304．(不定项)如图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性内切核酸酶。下列说法正确的是(

)A．图示过程是基因工程的核心步骤B．表达载体构建时需要用到限制酶SmaⅠC．抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来D．除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构ACD三、将目的基因导入受体细胞导入

植物细胞导入动物细胞导入微生物细胞农杆菌转化法（常用）花粉管通道法（我国独创）——显微注射法——Ca2+处理法操作方法：①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；②在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。花粉管通道法①利用植物授粉后形成的天然花粉管通道，将外源基因携带进入胚囊，此时的受精卵未形成细胞壁，且正在进行活跃的DNA复制，容易将外源DNA片段易整合到受体基因组中。②操作简单、技术成本低，免去了组织培养以及诱导再生植株的全套人工培养过程。优点教材81农杆菌转化法1、转化：目的基因进入________内，并且在受体细胞内_____和___的过程。受体细胞维持稳定表达2、农杆菌特点：易感染

植物，对大多数

植物没有感染能力。3、原理：农杆菌细胞内的Ti质粒上的

可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。4、方法：①新取的叶片与农杆菌共培养，筛选转化细胞，再生成新植株；②花序直接浸没在农杆菌溶液中一段时间，培养植株获得种子，筛选鉴定。双子叶植物和裸子单子叶T-DNA实质：基因重组将目的基因导入动物细胞①方法:

。②受体细胞：

。

显微注射技术

受精卵【思维拓展】为什么受体细胞选受精卵而不是正常体细胞？受精卵具有体积大,易操作，全能性高，易培养成完整个体；而动物体细胞的全能性受限将目的基因导入微生物细胞①常用法:

.②常用菌：

。③微生物作为受体细胞的原因是

。④原理：

Ca2+处理法

大肠杆菌繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少注意：原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常

没有生物活性，需要在体外进行再加工。增加细胞壁的通透性，可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态（感受态细胞）。2．下列关于目的基因导入受体细胞的叙述，不正确的是()A．花粉管通道法的操作之一是用微量注射器将含有目的基因的溶液直接注入子房中B．显微注射技术是转基因动物中采用最多的方法C．大肠杆菌最常用的转化方法是：使细胞的生理状态发生改变D．农杆菌转化法是我国科学家独创的一种方法大本P329D将基因表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？即使导入成功，如何判断目的基因是否可以正常表达？思考不一定！检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。目的：检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性——通过PCR等技术检测①检测目的基因是否导入②检测目的基因是否转录③检测目的基因是否翻译——通过抗原-抗体杂交检测检测内容及方法:（一）分子水平的检测（二）个体生物学水平的检测检测目的基因是否表现出相应的性状采摘抗虫棉叶片饲喂棉铃虫观察棉铃虫存活情况四、目的基因的检测与鉴定PCR扩增转基因生物提取DNADNA作为模板PCR操作是否扩增出目的基因电泳操作M：marker；1-阳性质粒；2：原始品系；3-9转Bt品系；转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果基因是否插入染色体DNA（存在）知识拓展个体生物学水平的鉴定具体方法举例转基因生物鉴定方法成功标志抗虫植物抗病毒（菌）植物抗盐植物抗除草剂植物获取目的基因产物的转基因生物饲喂害虫（害虫接种实验）害虫死亡病毒（菌）接种实验未染病盐水浇灌正常生长喷洒除草剂正常生长提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较功能、活性正常大本P329(1)图中的标记基因是哪一个，你是如何确定的？

(2)被转化的细菌有哪三种？(3)图示筛选含目的基因细菌的方法是怎样的？

是氨苄青霉素抗性基因。目的基因插入四环素抗性基因内部，使四环素抗性基因失活。含环状目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含自身环化质粒的细菌。先将混合细菌接种到含氨苄青霉素的培养基上，能生长的是含重组质粒的和含自身环化质粒的细菌；再接种到含四环素的培养基上，不能生长的是含目的基因的菌落，最后从含氨苄青霉素的培养基上挑取相应菌落进行培养即可。目的基因筛选和获取基因表达载体的构建

（核心步骤）将目的基因导入受体细胞目的基因的检测和鉴定基因工程的基本操作程序小结1.利用PCR获取和扩增目的基因2.人工合成法

3.从基因文库中获取1.导入植物细胞：农杆菌转化法；花粉管通道法2.导入动物细胞：显微注射法（受精卵）3.导入原核细胞：用Ca2+处理受体细胞2.(2022·全国乙卷，38)新冠疫情出现后，病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作用。回答下列问题： (1)新冠病毒是一种RNA病毒，检测新冠病毒RNA(核酸检测)可以采取RT—PCR法。这种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA，这一过程需要的酶是________________________，再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。(2)为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的_____________________来进行。PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是______________。逆转录酶(或反转录酶)

特异性核苷酸序列复性(或退火)(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测(检测体内是否有新冠病毒抗体)，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明________________________(答出1种情况即可)；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明__________________________。(4)常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异性蛋白S(具有抗原性)的编码序列(目的基因)。为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是_________________________