转基因动物用微生物安全性评价专家讲座

生物安全

Biosafety

动、植物用转基因微生物安全性红河学院生命科学与技术学院转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第1页微生物特点个体小繁殖快数量大易变异分布广泛生命力强轻易扩散转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第2页内容提要（1）动、植物用转基因微生物发展概况；（2）动物用转基因微生物安全性评价（受体微生物安全性评价、转基因操作安全性评价、动物用转基因微生物安全性评价、动物用转基因微生物产品安全性评价）；（3）植物用转基因微生物安全性评价（受体微生物安全性评价、转基因操作安全性评价、植物用转基因微生物安全性评价、植物用转基因微生物产品安全性评价）；（4）动、植物用转基因微生物安全管理（国外、国内）。转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第3页动、植物用转基因微生物定义动物用转基因微生物主要包含动物用转基因活疫苗和动物用转基因活微生物饲料添加剂；植物用转基因微生物是指经过重组DNA技术研制，直接应用于植物上含有杀虫、防病、固氮、调整生长等作用微生物。转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第4页（一）转基因微生物概况转基因动物用微生物研究与开发起步于20世纪80年代初口蹄疫病毒是最早研究对象国际上发达国家对基因工程疫苗研究与开发十分重视已相继研制成功一些用于动物疫病免疫预防用基因工程亚单位疫苗、基因工程重组活载体疫苗、基因缺失疫苗、DNA疫苗等转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第5页1.转基因微生物饲料添加剂酶制剂以基因工程研制能高效表示植酸酶重组毕氏酵母。抗菌肽降低或完全替换抗生素药品。重组生长激素转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第6页2.基因工程亚单位疫苗利用体外表示系统（如大肠杆菌，酵母，动物细胞，杆状病毒-昆虫细胞等）表示病毒主要保护性抗原蛋白作为亚单位疫苗不但含有优良安全性，而且便于规模化生产利用非疫苗用蛋白作为抗原建立诊疗方法将能够区分亚单位疫苗免疫动物和自然感染动物转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第7页包括动物病原大多数禽、猪、牛等动物病原体免疫原性蛋白（保护性抗原）FMDVVP1、狂犬病病毒囊膜蛋白G，AIVHA蛋白，伪狂犬病病毒囊膜糖蛋白gP50，新城疫病毒F和HN蛋白,传染性法氏囊病毒VP2蛋白，传染性胃肠炎病毒纤突蛋白，鸡传染性贫血病病毒衣壳蛋白（VP1）……….转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第8页2.基因工程重组活载体疫苗

痘病毒、疱疹病毒、腺病毒或细菌作为载体含有常规弱毒疫苗全部优点便于构建多价疫苗利用非疫苗用基因或其表示产物能够建立判别诊疗方法

转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第9页利用痘病毒作为载体痘苗病毒数十种病原基因在痘苗病毒中进行了表示，都显示出不一样程度免疫保护性。比较成功有表示狂犬病病毒G蛋白重组痘苗病毒和表示牛瘟病毒F和HA蛋白重组痘苗病毒疫苗

禽痘病毒（鸡痘病毒、金丝雀痘病毒、鸽痘病毒）转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第10页新城疫病毒F和HN蛋白禽流感病毒HA和NP蛋白马立克氏病毒gB糖蛋白禽白血病囊膜蛋白传染性法氏囊病病毒VP2蛋白禽网状内皮增生症病毒囊膜蛋白火鸡出血性肠炎病毒Hexon蛋白转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第11页利用腺病毒作为载体当前已经有许多外源基因被插入腺病毒并得到表示SIV水疱性口炎病毒狂犬病病毒牛副粘病毒3型牛疱疹病毒I型牛冠状病毒猪传染性胃肠炎病毒转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第12页利用疱疹病毒作为载体火鸡疱疹病毒、伪狂犬病病毒、牛疱疹病毒I型和鸡传染性喉气管炎病毒已完成动物试验并显示出良好前景重组疱疹病毒疫苗：口蹄疫病毒VP1基因，猪瘟病毒E2基因，猪繁殖与呼吸综合症病毒GP5基因，猪流感病毒HA基因重组伪狂犬病毒疫苗表示传染性法氏囊病毒VP2基因重组马立克氏病毒疫苗表示禽流感病毒HA基因重组传染性喉气管炎病毒疫苗转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第13页利用细菌作为载体大肠杆菌沙门氏菌李氏杆菌当前国际上基因工程疫苗研究与开发热点之一转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第14页3.基因缺失疫苗

一类发展前景很好基因工程疫苗伪狂犬病基因缺失疫苗(双基因和三基因缺失疫苗，如TK-/gG-、TK-/gE-、TK-/gC-和TK-/gE-/gI-等，并已商品化生产牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）TK基因缺失疫苗转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第15页4.DNA疫苗DNA疫苗可诱导机体同时产生体液免疫和细胞免疫已发觉DNA接种对许多病毒、细菌、寄生虫感染以及肿瘤预防都有一定效果转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第16页其它疫苗可食性疫苗(利用转基因植物)多表位疫苗T细胞疫苗RNA复制子疫苗转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第17页基因工程疫苗产业化与应用是当前和今后发展趋势

含狂犬病毒gB基因重组牛痘病毒疫苗，已在北美和欧洲广泛应用于预防野生动物狂犬病TK和gE双基因缺失伪狂犬病疫苗已在美国和大部分欧盟国家广泛应用于预防猪伪狂犬病和猪伪狂犬病根除计划TK和gE双基因缺失牛传染性鼻气管炎病毒疫苗也在许多国家使用，荷兰于1998年5月在全国范围内推广使用TK和gE双基因缺失疫苗方便根除此病表示禽流感病毒HA基因重组鸡痘病毒疫苗和表示新城疫病毒F基因重组鸡痘病毒疫苗也已取得美国农业部注册，开始产业化生产转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第18页2、国内研发情况我国动物用基因工程疫苗研究与发达国家之间没有实质性差距，而且取得了巨大进展十五期间，国家863计划在动物用基因工程疫苗与诊疗试剂研究与开发方面投入有所加强近几年，我国动物用基因工程疫苗研究展现出加速发展态势，已经有各种基因工程疫苗已经问世，并进入安全性评价不一样阶段转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第19页包括主要疫病禽流感病毒鸡新城疫病毒禽传染性喉气管炎病毒鸡传染性法氏囊病病毒鸡马立克氏病病毒猪伪狂犬病病毒猪瘟病毒口蹄疫病毒猪繁殖与呼吸综合征病毒猪圆环病毒2型猪传染性胸膜肺炎放线杆菌大肠杆菌猪囊虫转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第20页第一个商品化疫苗——仔猪腹泻大肠杆菌K88/K99二价基因工程疫苗转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第21页已经过农业转基因生物安全评价，并取得农业部新兽药证书，进入产业化生产和应用阶段基因工程疫苗

禽流感重组灭活疫苗禽流感重组鸡痘病毒活载体疫苗传染性喉气管炎重组鸡痘病毒活载体疫苗伪狂犬病基因缺失疫苗“O”型口蹄疫病毒基因工程疫苗

以新城疫病毒为载体重组禽流感疫苗转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第22页已经过农业部农业转基因生物安全评价疫苗猪生长抑素基因工程疫苗马立克氏病基因工程活载体疫苗猪囊虫核酸疫苗幼畜腹泻双价基因工程苗新城疫重组鸡痘病毒基因工程疫苗动物去势疫苗转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第23页进入安全性评价不一样阶段产品越来越多，数量不停上升各类动物疫病基因工程亚单位疫苗以禽痘病毒、伪狂犬病病毒、腺病毒为载体基因工程重组活载体疫苗细菌基因缺失疫苗DNA疫苗转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第24页饲料用转基因微生物在我国也取得成功转植酸酶酵母已经过农业部转基因生物安全评价，并已产业化生产和应用近年来以转基因植物为表示系统可食性疫苗也已成为我国研究热点转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第25页基因工程疫苗产业化和商品化是我国在这一领域发展方向怎样提升基因工程疫苗免疫效力，到达或超出常规传统疫苗免疫保护效果，以期在我国动物疫病预防和控制中发挥作用，也是当前和今后我国科学家所面临主要任务转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第26页3.转基因微生物农药杀虫转基因微生物转基因病毒杀虫剂、转基因Bt制剂、防病转基因微生物。转基因微生物肥料遗传改良联合固氮菌和根瘤菌。转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第27页1、安全评价标准、技术指标要求安全评价标准

安全评价内容及其技术指标要求

转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第28页(1)安全评价标准

1、是以促进基因工程技术发展和应用，同时保障人类健康和生态环境平衡为基本标准2、采取个案分析，实事求是标准3、从受体微生物安全性、基因操作安全性和转基因动物用微生物遗传工程体及其产品安全性等三个方面内容和对动物、人类与环境安全性三个角度进行评价（1）从动物安全角度，着重评价转基因动物用微生物遗传工程体及其产品对靶动物和非靶动物安全性（2）从人类健康角度，着重评价对人类、畜禽以及形成食物链（食品）影响（3）从生态环境角度，着重评价转基因动物用微生物遗传工程体及其产品对自然生态环境和畜牧业生态环境影响转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第29页4、包括到危害人类、动物健康和生态环境平衡转基因微生物遗传工程体及其产品，应对其安全性进行严格评价5、从事转基因动物用微生物研究机构或个人应逐层申报。国外企业在我国申请注册转基因动物用微生物遗传工程体及其产品，应按阶段进行安全性评价6、农业部农业基因安全审评委员会仅负责对转基因微生物遗传工程体及其产品安全性进行评价，所以经过安全性评价（指取得生物安全证书）转基因微生物遗传工程体及其产品，需申报兽用新生物制品进行审批，取得兽用新生物制品证书后方能进行商品化生产和应用转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第30页（2）安全评价内容及其技术指标要求

安全性评价总体内容安全性评价阶段及其要求试验方案

主要动物用转基因微生物及其产品安全性评价相关技术资料

转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第31页1、安全性评价总体内容受体微生物安全性评价与安全等级确实定（1）所用受体微生物(包含细菌、病毒)可接触到环境（2）受体微生物生物学背景与特征学名和分类地位，分布、繁殖方式在环境中定殖、存活和传输能力与路径及影响原因致病性和产生毒素及毒性物质能力，在国内外应用情况（3）受体微生物对人类、动物和其它微生物影响和潜在危险程度，受体微生物受人类和动物其它病原体侵染情况（4）受体微生物对生态环境影响和潜在危险程度（5）受体微生物质粒情况，发生遗传变异可能性及其潜在危险程度（6）对受体微生物监测方法和监控技术受体微生物安全性等级按《农业转基因生物安全评价管理方法》（第二章）确定转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第32页基因操作安全性评价内容与等级确定

（1）目标基因起源、结构、免疫学与生物学功效和用途

（2）基因操作所用载体名称、起源、特征与结构、安全性，载体所带抗性标识基因及其特征（3）重组DNA分子结构、构建方法、复制特征和安全性（4）转基因方法（5）目标基因在受体微生物及宿主体内表示及其遗传稳定性基因操作安全性等级按《农业转基因生物安全评价管理方法》（第二章）确定转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第33页转基因动物用微生物遗传工程体及其产品安全性评价内容

（1）转基因动物用微生物遗传工程体分子学与生物学特征（2）在自然界存活能力（3）遗传物质转移到其它生物体能力和可能后果（4）与其它病原微生物重组能力和可能产生后果（5）遗传工程体应用目标和范围（6）对遗传工程体应有适当监测方法和监控伎俩转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第34页遗传工程体及其产品对动物安全性

在靶动物和非靶动物体内生存前景对靶动物和可能非靶动物高剂量接种后影响与传统产品相比较，其相正确安全性宿主范围与载体漂移度免疫动物与靶动物以及非靶动物接触时排毒和传输能力遗传工程体回复传代时毒力返强能力对妊娠动物安全性对免疫动物子代安全性转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第35页遗传工程体及其产品对人类安全性

人类接触和感染可能性及其危险性广泛应用后对人类潜在危险性转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第36页遗传工程体及其产品对生态环境安全性

遗传工程体在环境中释放范围影响遗传工程体在外界环境中存活、增殖和传输理化原因感染靶动物和非靶动物可能性或潜在危险性转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第37页2、安全性评价阶段及其要求中间试验环境释放生产性试验安全证书申请转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第38页（1）中间试验

项目名称应包含目标基因名称、动物用转基因微生物及产品名称、试验所在省（市、自治区）名称和试验阶段名称四个部分，如表示鸡新城疫病毒F基因重组鸡痘病毒基因工程疫苗在江苏省中间试验一份申请书中菌株不超出20个，且是由同一个受体微生物、相同目标基因、相同基因操作所取得，而且每个转基因菌株都应有明确名称或编号转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第39页试验地点不超出3个省（市、区），每省不超出2个点试验动物总规模（上限）大动物（马、牛）20头中小动物（猪、羊等）40头禽类（鸡、鸭等）200羽鱼尾试验地点应明确试验所在省（市、自治区）、县（市）、乡、村试验年限普通为1~2年转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第40页申报中间试验应提供以下相关附件资料目标基因核苷酸序列和推导氨基酸序列目标基因与载体构建图谱试验地点位置图和试验隔离图试验设计（包含进行安全性评价主要指标和研究方法等，如转基因微生物稳定性、竞争性、生存适应能力、外源基因在靶动物体内表示和消长关系等）转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第41页（2）环境释放

项目名称应包含目标基因名称、动物用转基因微生物及产品名称、试验所在省（市、自治区）名称和试验阶段名称四个部分，如表示鸡新城疫病毒F基因重组鸡痘病毒基因工程疫苗NF16和YF9在江苏省环境释放一份申报书中菌株不超出5个，且是由同一个受体微生物、相同目标基因、相同基因操作所取得，每个菌株都应有明确名称或编号，并与中间试验阶段相对应转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第42页试验地点不超出3个省（市、区），每省不超出3个点试验动物总规模（上限）大动物（马、牛）100头中小动物（猪、羊等）500头禽类（鸡、鸭等）5000羽鱼10000尾试验地点应明确试验所在省（市、自治区）、县（市）、乡、村一次申请环境释放期限普通为1~2年转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第43页申请环境释放应提供以下相关附件资料目标基因核苷酸序列和推导氨基酸序列目标基因与载体构建图谱中间试验阶段安全性评价试验总结汇报毒理学试验汇报（假如必要话）试验地点位置图和试验隔离图试验设计（包含进行安全性评价主要指标和研究方法等，如转基因微生物稳定性、竞争性、生存适应能力、外源基因在靶动物体内表示和消长关系等）转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第44页（3）生产性试验项目名称应包含目标基因名称、动物用转基因微生物及产品名称、试验所在省（市、自治区）名称和试验阶段名称四个部分，如表示鸡新城疫病毒F基因重组鸡痘病毒基因工程疫苗NF16在江苏省生产性试验一份申报书只能申请1种动物用转基因微生物，且名称应与前期试验阶段名称和编号相对应转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第45页试验地点应在同意过环境释放省（市、自治区）进行，但不能超出2个省（市、区），每省不超出3个点试验动物总规模（上限）大动物（马、牛）1000头中小动物（猪、羊等）10000头（只）禽类（鸡、鸭等）0羽鱼100000尾试验地点应明确试验所在省（市、自治区）、县（市）、乡、村一次申请生产性试验期限普通为1~2年转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第46页申请生产性试验应提供以下相关附件资料目标基因核苷酸序列和推导氨基酸序列目标基因与载体构建图谱环境释放阶段审批书复印件中间试验和环境释放安全性评价试验总结汇报食品安全性检测汇报（假如必要话）目标基因或动物用转基因微生物向环境中转移情况汇报试验地点位置图和试验隔离图试验设计（包含进行安全性评价主要指标和研究方法等，如转基因微生物稳定性、竞争性、生存适应能力、外源基因在靶动物体内表示和消长关系等）转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第47页（4）安全证书申请

安全证书申请项目应包含目标基因名称、转基因微生物名称，如表示鸡新城疫病毒F基因重且鸡痘病毒基因工程疫苗NF16安全证书一份申报书只能申请1种动物用转基因微生物，其名称应该与前期试验阶段名称或编号相对应一次申请安全证书使用期限普通不超出5年转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第48页申请安全证书应提供以下相关附件资料目标基因核苷酸序列和推导氨基酸序列目标基因与载体构建图谱目标基因分子检测或判定技术方案重组DNA分子结构、构建方法；各试验阶段审批书复印件各试验阶段安全性评价试验总结汇报目标基因或转基因微生物向环境中转移情况汇报稳定性、生存竞争性、适应能力等综合评价汇报对非靶生物影响汇报食品安全性检测汇报（假如必要话）该类动物用转基因微生物在国内外生产应用概况其它相关资料转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第49页3、试验方案

试验方案应明确：试验所在地域及畜禽场名称及其周围环境资料试验所在区域生态类型与动物种类试验所在区域动物疫病流行情况试验所在区域生态环境对遗传工程体存活、繁殖、扩散和传输有利或不利原因，尤其是环境中其它生物从遗传工程体取得目标基因可能性转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第50页有明确试验起止时间确定试验动物、动物数量和试验区域大小参加试验人员情况对应隔离和环境监控办法转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第51页提出用于监测试验区域和周围环境中遗传工程体适当方法和程序，监测方法应该敏感性高和特异性强详细统计监测结果，提出遗传工程体及其产品稳定生产工艺，包装规格和贮存条件，明确遗传工程体及其产品接种剂量和路径，使用产品总量，剩下产品处理方法，提出试验动物喂养和试验后处理方法，应提出试验所在区域消毒办法，提出试验实施过程中出现意外事故应急办法，明确试验结束后监控办法和年限转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第52页4、主要动物用转基因微生物及其产品安全性评价相关技术资料

基因工程亚单位疫苗和基因工程灭活疫苗重点评价受体微生物、基因操作、重组微生物安全性，其产品本身安全性不存在问题利用重组微生物、基因缺失微生物制备基因工程灭活疫苗应重点评价受体微生物、基因操作和转基因微生物安全性，基因重组和基因缺失对受体微生物致病性及其表型可能造成影响、转基因微生物安全性（亚单位疫苗或灭活疫苗可经过中间试验后，直接申报安全证书）转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第53页基因工程重组活载体疫苗应重点评价受体微生物、基因操作和重组微生物及其产品安全性评价试验内容：重组微生物稳定性、重组微生物中外源基因稳定性、外源基因在免疫动物体内表示和消长情况、重组微生物对免疫动物安全性及对环境安全性等（利用已知载体研制基因工程重组活载体疫或者可跨越环境释放或生产性试验，而申请安全证书）

转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第54页基因缺失活疫苗应重点评价祖代微生物、基因操作和缺失微生物及其安全性安全性评价试验内容：缺失微生物稳定性、缺失微生物致病性和对免疫动物安全性、缺失微生物与野生型微生物重组可能性、基因缺失微生物排毒和传输能力及其对环境安全性转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第55页DNA疫苗应评价质粒DNA安全性重组质粒DNA在免疫动物体内存留时间与对宿主染色体或基因影响与宿主染色体整合潜在可能性DNA疫苗免疫接种时局部反应性和全身性毒性DNA疫苗潜在致肿瘤性转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第56页（三）国内外安全管理情况

国外对包括基因操作制备转基因动物用微生物及其产品（基因工程疫苗）安全性也十分重视美国和欧洲一些国家即使没有设置专门评价机构和管理机构，但在评价这类产品安全性方面，增设了与转基因安全相关评价内容和要求，在进行疫苗评审时一同进行审查转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第57页我国十分重视农业转基因生物安全管理，将转基因动物用微生物（疫苗等）安全管理纳入国家农业转基因生物安全管理范围，颁布了相关管理法规和条例，在国家农业转基因安全评价委员会设置了动物用转基因微生物安全评价小组，对转基因动物用微生物安全性进行评价，同时与我国农业部新生物制品评审相衔接转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第58页（四）案例分析以基因工程活载体疫苗——（表示传染性喉气管炎病毒gB基因重组鸡痘病毒基因工程疫苗）为例转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第59页（一）安全性评价及其依据受体微生物安全性评价基因操作安全性评价动物用转基因微生物安全性评价动物用转基因微生物产品安全性评价

参考《农业转基因生物安全评价管理方法》附录“动物用转基因微生物安全性评价”,逐条进行评价和表述，并提出安全性评价依据

转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第60页关于受体微生物——鸡痘病毒鸡痘病毒S-FPV-017疫苗株，广泛应用，有长久应用安全统计对人类健康或生态环境没有危害

转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第61页关于基因操作所包括载体、开启子、目标基因已在国内外试验室广泛使用，均含有科学试验数据和良好长久安全应用统计，所构建转移载体不带危险性标识基因和汇报基因，导入受体微生物后，不带标识基因而仅带汇报基因，使受体微生物取得了表示鸡传染性喉气管炎病毒gB基因抗原新特征，这种遗传性状改变对人类健康和生态环境没有不利影响转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第62页关于重组鸡痘病毒S-FPV-017株病毒和重组病毒免疫鸡，表现相同安全性，致病性没有增加重组鸡痘病毒在鸡胚连续传10代，对鸡毒力及免疫力没发生变异转基因动物用微生物安全性评价专家讲座第63页（二）各阶段安全性评价内容

申报中间试验、环境释放和生产性试验，申报单位需要提出进行安全性评价试验内容，作为基因工程活载体疫苗，重点应对以下内容进行评价，并设计相关试验方案转基因