双水相分离蛋白酶

试验目标1.掌握双水相概念；2.掌握双水相技术概念；3.掌握双水相提取酶与蛋白质原理；4.了解影响双水相技术提取效率原因。双水相分离蛋白酶第1页1956年,瑞典Lund大学学者Albertson首次利用双水相萃取技术(ATPE)分离生物分子。

20世纪70年代以后，Hustedt、Kula和Johansson等人又将双水相萃取技术应用于生物产品分离。

自20世纪80年代早期起，双水相萃取技术开始应用于工业生产，国内也开展了相关研究。双水相分离蛋白酶第2页人们已经陆续考查了蛋白质、核酸、病毒、细胞及细胞颗粒在ATPS中分配行为，从工艺流程、操作参数、成本分析等方面对双水相萃取技术工业应用进行了分析和尝试，为发展双水相萃取技术奠定了坚实基础。双水相分离蛋白酶第3页当一定浓度某种有机物水溶液与其它有机物水溶液，或者有机物水溶液与无机盐水溶液以一定体积比混合时，能够自然分相并形成互不相溶双水相或者多水相体系，这就是双水相体系。双水相分离蛋白酶第4页双水相形成机理很复杂。

不一样成相原理能够解释不一样组成双水相体系，但各种原理并不能普遍适用，而且各种原理间相互关系也十分复杂。双水相分离蛋白酶第5页双水相萃取与普通水/有机物萃取原理相同，都是依据物质在两相间选择性分配。

当萃取体系性质不一样，物质进入双水相体系后，因为分子间范德华力、疏水作用、分子间氢键、分子与分子之间电荷作用，目标物质在上、下相中浓度不一样，从而到达分离目标。双水相分离蛋白酶第6页溶质(包含蛋白质等大分子物质、稀有金属以及贵金属络合物、中草药成份等)在双水相体系中服从Nernst分配定律:

K=Ct/Cb

其中Ct、Cb分别代表溶质在上相、下相中浓度。双水相分离蛋白酶第7页

系统固定时，分配系数为一常数，与溶质浓度无关。

当目标物质进入双水相体系后，在上相和下相间进行选择性分配，这种分配关系与常规萃取分配关系相比，表现出更大或更小分配系数。

如各种类型细胞粒子、噬菌体分配系数都大于100或者小于0.01，所以为物质分离提供了可能。双水相分离蛋白酶第8页影响物质在双水相体系中分配原因主要包含双水相体系中有机相组成(如有机物类型、平均分子量等)、盐类(包含离子类型和浓度、电荷数、电解质强度、酸碱性等)、相比R(上下相体积比)、溶质即待分离物质物理化学性质(包含分子量,等电点)以及体系温度、压力等。双水相分离蛋白酶第9页这些原因不是独立起作用，所以要预测待分离物质在双水相体系间分配系数相当困难。

当前只能是边试验边确定最正确分配条件。双水相分离蛋白酶第10页pH影响双水相体系中pH值能够经过影响蛋白质分子上可离解基团离解度，从而改变蛋白质表面电荷数来影响分配，它还能够经过影响缓冲离子如HPO2-4

、PO3-4

等分配，以改变相间电位来到达改变分配系数目标。

不一样种类中性盐也会因为电位差不一样，而造成分配系数与pH值关系不一样。双水相分离蛋白酶第11页温度影响温度改变也会经过影响相物理性质（如粘度和密度等）改变来影响蛋白质分配。

但总来说，温度对分配系数影响是经过对相图影响来间接到达。

在临界点附近，温度对相图影响最显著，对分配系数影响最强。双水相分离蛋白酶第12页当远离临界点时，温度对相图影响较小，分配系数对温度改变也不敏感。

这是因为远离临界点时，成相聚合物浓度增大，对蛋白质稳定作用增强。双水相分离蛋白酶第13页中性盐影响中性盐种类不一样，其正负离子分配系数也不一样。

当它在双水相中电离时，为保持两相电中性，产生了不一样相间电位，从而影响蛋白质分配。

如在PEG-Dextran体系中加入NaClO4

或KI，可增加上相对带正电蛋白质亲和效应，并迫使带负电蛋白质进入下相；

若加入Li3PO4

，情况则相反。双水相分离蛋白酶第14页

故只要改变界面电势就可控制荷电蛋白质转入所需要相中。

盐浓度对分配系数影响主要反应在对蛋白质疏水性影响上。双水相分离蛋白酶第15页有机共溶剂影响在双水相体系中添加少许有机共溶剂，使得体系中一部分水被有机共溶剂所取代，造成两相界面处疏水性能差异发生改变，同时界面张力以及电位差也随之改变，从而影响了蛋白质分配。

通常认为，有机共溶剂对被分配物质分配行为影响，更主要是有机溶剂和成相高聚物相互作用结果。双水相分离蛋白酶第16页添加表面活性剂能够改变界面张力、上下相组成等两相特征，从而对物质分配行为进行调整。双水相分离蛋白酶第17页双水相萃取技术优势双水相萃取经过溶质在两水相之间分配系数差异而进行萃取。

在蛋白质分离纯化过程中，双水相体系含水量高，可达80%以上，萃取环境和操作条件温和，蛋白质在其中不易失活；

界面张力远远低于水-有机溶剂两相体系界面张力，有利于强化相际间质量传递；

易于按百分比放大和进行连续性操作等。双水相分离蛋白酶第18页双水相萃取技术这些优势，使之被广泛用于蛋白质分离纯化，效果很好。

近年来，双水相萃取技术分离对象已涵盖了多肽、氨基酸、植物有效成份、重金属离子和抗生素等方面。双水相分离蛋白酶第19页双水相萃取技术种类在生物分离工程中惯用双水相萃取技术（ATPS）有两类。

第一类是非离子型聚合物/非离子型聚合物/水系统，第一类体系对生物活性物质变性作用低、界面吸附少，不过所用聚合物(如葡聚糖)成本较高，而且体系黏度大，在工业化大规模生产时从经济角度丧失了该系统优势;双水相分离蛋白酶第20页第二类是非离子型聚合物/无机盐/水系统。

第二类成本相对低，黏度小，不过因为高浓度盐废水不能直接排入生物氧化池，使其可行性受到环境保护限制，且有些对盐敏感生物物质会在这类体系中失活。

所以，研究成相材料、建立新型ATPS成为双水相萃取技术主要发展方向之一。双水相分离蛋白酶第21页菠萝蛋白酶（bromelain）是从菠萝果实和茎中制取分离出蛋白水解酶总称，依据制取分离部位不一样，分为果菠萝蛋白酶（fruitbromelain）和茎菠萝蛋白酶（stembromelain）。双水相分离蛋白酶第22页1891年，Chittenden等首先用硫酸铵沉淀法从菠萝果实中分离出了果菠萝蛋白酶。

1957年，