外源化学物的特殊毒性

外源化学物的特殊毒性

第一节生殖毒性及评价方法要求：

1、掌握生殖发育毒性的基本概念

2、熟悉生殖发育毒性的评价方法

3、能完成常规生殖发育毒性试验的设计第2页,共39页，2024年2月25日，星期天

概述繁殖过程:生殖细胞(配子)精子卵细胞发生卵细胞受精卵细胞着床胚胎形成胚胎发育器官发生分娩哺乳胎仔发育生殖毒理学发育毒理学幼仔发育第3页,共39页，2024年2月25日，星期天一、生殖毒性(reproductivetoxicity)

生殖毒性指对雄性和雌性生殖功能或能力的损害和对后代的有害影响。生殖毒性既可发生于妊娠期，也可发生于妊前期和哺乳期。表现为外源化学物对生殖过程的影响，例如生殖器官及内分泌系统的变化，对性周期和性行为的影响，以及对生育力和妊娠结局的影响等。第4页,共39页，2024年2月25日，星期天二、发育毒性(developmentaltoxicity)

发育毒性指在到达成体之前诱发的任何有害影响，包括在胚期(embryonicperiod)和胎期(fetalperiod)诱发或显示的影响，以及在出生后诱发和显示的影响。发育毒性的主要表现为：

1.发育生物体死亡(deathofthedevelopingorganism)2.生长改变(alteredgrowth)3.功能缺陷(functionaldeficiency)4.结构异常(structuralabnormality)第5页,共39页，2024年2月25日，星期天雄性生殖毒性一、雄性生殖细胞的发生过程第6页,共39页，2024年2月25日，星期天二、外源化学物的雄性生殖毒性

（一）对睾丸生精细胞的影响睾丸曲细精管生殖细胞支持细胞精原细胞精母细胞精细胞提供营养、保护、支持第7页,共39页，2024年2月25日，星期天(二)对内分泌功能的影响下丘脑垂体睾丸促性腺激素释放激素GnRH促性腺激素雄性激素促卵泡素FSH黄体生成素LH(三)对性功能和生殖功能的影响第8页,共39页，2024年2月25日，星期天三、雄性生殖毒性的检测方法

（一）精子分析

(1)精子计数：是雄性性功能的一项重要指标，可提供有关精子发育与成熟方面的粗略信息。

(2)精子形态观察：精子头和尾的形态学改变可影响精子运动和穿透卵细胞的能力。

(3)精子状态分析试验：包括有精液的pH、液化时间，精子运动能力，蛋白质、脂质和微量元素的含量等。可了解精子所处的微环境及精子运动等情况。

（二）精子穿透实验精子穿透实验实际上就是精子体外授精的实验。第9页,共39页，2024年2月25日，星期天

（三）睾丸中标志酶活性检测

一类酶其含量和活性随着精子的形成、成熟而增高，如乳酸脱氢酶同工酶、山梨醇脱氢酶、透明质酸酶、α-磷酸甘油脱氢酶等；一类则是随着精子的形成、成熟，其活性下降，如6-磷酸葡萄糖脱氢酶、苹果酸脱氢酶、三磷酸甘油醛脱氢酶以及异柠檬酸脱氢酶等。第10页,共39页，2024年2月25日，星期天（四）体外试验1.睾丸支持细胞的分离与培养2.睾丸间质细胞的分离和培养

（五）雄性激素的检测睾丸雄性激素FSHLH雄激素(睾酮)支持细胞间质细胞雄性激素结合蛋白睾酮生殖功能第11页,共39页，2024年2月25日，星期天（六）显性致死试验（dominantlethalassay）

给予雄性动物化学物，将其与未经受试物处理的雌性动物交配，观察雌性动物早期胚胎死亡情况，以评价受试物对雄性动物的生殖细胞有无损害作用的试验。由于此种损害在子代的第一代即可表现，故称为“显性”。该试验观察指标为早期胚胎死亡，所以称之为显性致死试验。

第12页,共39页，2024年2月25日，星期天（七）雄性生殖细胞遗传毒性检测

小鼠睾丸染色体畸变分析、小鼠精子畸变分析、黑腹果蝇染色体隐性分析试验、单细胞凝胶电泳试验（singlecellgelassay，SCG），又称慧星试验（cometassey）。第13页,共39页，2024年2月25日，星期天Figure1DNAofalivecell.NoDNAdamageisobserved.Figure2After30minutesofsonicationinthepresenceofencapsulatedDOX,mostofthenuclearDNAisintactbutsmallpieceshavemigrated.Figure3MoreDNAdamagebutthecellsarestillalive(1hrofsonicationinthepresenceofencapsulatedDOX).Figure4Thecellclearlydeadbyapoptosis.TheDNAinthecellisfragmentedandthenuclearDNAcanbarelyberecognized(2hoursofsonicationinthepresenceofencapsulatedDOX).第14页,共39页，2024年2月25日，星期天雌性生殖毒性一、雌性生殖细胞的发生过程第15页,共39页，2024年2月25日，星期天卵巢

卵泡

支持细胞卵细胞

颗粒细胞

膜细胞

（二）排卵和受孕排出黄体精子退化受孕白体进一步形成第16页,共39页，2024年2月25日，星期天下丘脑垂体卵巢促性腺激素释放激素GnRH促性腺激素雌激素促卵泡素FSH黄体生成素LH（三）内分泌调节第17页,共39页，2024年2月25日，星期天二、外源化学物的雌性生殖毒性（一）对卵细胞的影响（二)对内分泌功能的影响

(三)其它毒作用三、雌性生殖毒性检测方法（一）体外试验应用超排卵的卵子与化学物共培养或处理组雌性动物的卵子进行体外受精.第18页,共39页，2024年2月25日，星期天三、雌性生殖毒性检测方法

（一）体外试验应用超排卵的卵子与化学物共培养或处理组雌性动物的卵子进行体外受精.第19页,共39页，2024年2月25日，星期天

整体动物试验仍为主要评价方法。常用的有两类：

1.一代繁殖试验或多代繁殖试验和致畸试验；

2.三段生殖试验，它分别在三个不同阶段给予受试物，即妊娠前期及初期、器官形成期、围产期及授乳期。三阶段生殖试验的第一、二阶段与传统的繁殖试验和传统的致畸试验基本相似，第三阶段是观察外源化学物对胎儿出生后发育的影响。（二）动物试验第20页,共39页，2024年2月25日，星期天

—代生殖毒性试验：是指亲代(F0)动物直接染毒受试物，仔一代(F1)在宫内和哺乳期接触受试物，其交配仅在F0代间进行，主要评价受试物对F0代青春期前后和成年动物亚慢性暴露的影响；

两代(多代)生殖毒性试验：是指仔代（F1和F2)从怀孕到出生前的宫内持续暴露和断奶前的持续暴露，即F0代直接染毒受试物，F1代既有直接接触，也有经母体的间接接触，仔二代(F2)在官内和哺乳期接触受试物，其交配在F0代间和F1代间进行，主要评价从染毒到发育全过程受试物对生殖功能的影响。第21页,共39页，2024年2月25日，星期天1、发情周期的观察

2、排卵的观察

3、雌性激素检测4、病理组织学检查

（三）其他辅助实验第22页,共39页，2024年2月25日，星期天致畸试验

致畸作用(teratogenicity)系在外源化学物对胚胎或胎儿发育过程的干扰作用下，造成胎儿在出生时，某种器官表现形态结构异常的过程。能诱发致畸作用的外源化学物称致畸物或致畸剂(teratogen)。第23页,共39页，2024年2月25日，星期天一、动物致畸试验（一）基本原理：妊娠母体接触某些具有致畸作用的化学物质，对于处在器官形成期的胚胎发育可产生不良影响，使胎仔形态结构发生缺陷而呈现畸形。因此，可以通过观察妊娠母体在敏感期接触受试物后胚胎及胎仔的发育状况来评价某种化学物质有无致畸作用。第24页,共39页，2024年2月25日，星期天（二）基本方法1.动物选择2.动物交配处理3.剂量分组4.孕鼠状况观察5.动物剖检6.胎仔检查

第25页,共39页，2024年2月25日，星期天1.动物选择

原则上应选择动物体内代谢途径与人类似，胎盘结构也基本与人相近，妊娠期短而一致，产仔数多，而且自发畸形率较低的实验动物，为此多选用大鼠或小鼠。

大鼠首选原因：对外源化学物代谢过程基本与人相似。受孕率高，产仔多。胎仔大小适中，易于观察。第26页,共39页，2024年2月25日，星期天2.动物交配处理

健康成年未曾孕产的大鼠，体重200~250g，小鼠20~25g。雌雄动物2:1比例于晚上合笼，次日早晨对雌鼠阴道涂片检查，查见精子或发现阴栓者揭示已交配过，定为孕鼠，以这一天作为妊娠第0天计算妊娠日数。将查出的孕鼠按随机区组法分组，每组10~20只。第27页,共39页，2024年2月25日，星期天3.剂量分组

一般高剂量组可选雌鼠LD50的1／3~1／5，低剂量组取1／30~1／50LD50的剂量；也可以亚慢性毒性实验中的最大无作用剂量为高剂量，以其1／30为低剂量。染毒：在雌鼠妊娠的第7~15天染毒，每日1次。染毒途径采用灌胃。

第28页,共39页，2024年2月25日，星期天4.孕鼠状况观察

在受试期间内应密切观察孕鼠的一般状况，每3天称量体重1次，通过体重的增减反映出受试物对孕鼠及胚胎的毒性程度。5.动物剖检

应在预期分娩的前一天处死母鼠进行检查。剖检前要称量交记录母鼠最终体重。做大体观察并记录黄体数、活胎数及吸收胎数。

6.胎仔检查

活胎数、晚期死胎数、早期死胎数、吸收胎数及各种胎仔的特征。逐一记录胎仔外观所见，对活胎仔要测量其体重、体长和尾长。

第29页,共39页，2024年2月25日，星期天第30页,共39页，2024年2月25日，星期天（三）结果判定1.母鼠妊娠期体重变化。2.平均着床数（％）＝3.平均活胎率=4.着床后死亡率（％）＝5.活胎仔平均体重、体长、尾长。6.畸形（外观、内脏及骨骼）总数。7.畸胎出现率（％）＝8.活胎仔畸形率（％）＝9.母体畸胎率（％）＝

第31页,共39页，2024年2月25日，星期天二、体外致畸作用试验

1.大鼠全胚培养(wholeembryoculture)2.器官培养(organculture)3.胚胎细胞微团培养(micmmassculture)4.水螅培养(hydraattenuataculture)

致畸指数：母体LD50与胎仔最小致畸作用剂量之比，这一比值愈大，致畸作用愈强，一般认为比值10以下者，不具致畸作用，10－100具致畸作用，100以上致畸作用强烈。第32页,共39页，2024年2月25日，星期天繁殖实验一、试验方法（一）实验动物：选择健康刚断乳（4周龄）大鼠，至少2个实验组和1个对照组。每组雌鼠20只，雄鼠10只（或20只）。（二）剂量分组：设对照组、低剂量组（可按最大无作用剂量的1／30或人类可能摄入量的100倍）、高剂量组（为最大耐受量或有胚胎毒性的剂量）。（三）染毒方式：一般采用将受试物加入饲料或饮水中，亲代和子代染毒方式和投予剂量应相同。（四）实验步骤：实验动物按设计剂量先摄入受试物12周，性发育成熟可开始交配。先将亲代（F0）雌鼠和雄鼠按常规方式交配，所生仔鼠为第一代（F1）。每代交配两次，故每代仔鼠共a、b两窝（一代