克隆基因的表达

关于克隆基因的表达第五章克隆基因的表达第一节基因表达的基本条件第二节原核表达载体的构建第三节克隆基因在植物细胞中的表达第2页,共57页，2024年2月25日，星期天第一节基因表达的基本条件1、基因表达的基本过程2、有效转录的基本条件3、正确翻译的基本条件4、影响克隆基因表达效率的因素第3页,共57页，2024年2月25日，星期天1、基因表达的基本过程第4页,共57页，2024年2月25日，星期天1、基因表达的基本过程

基因的表达主要涉及到两个过程：转录和翻译。首先，目的基因通过转录(transcription)形成mRNA（信使RNA,messengerRNA)；

然后，tRNA（转运RNA,transferRNA）将各种氨基酸运送到核糖体并按照mRNA的密码子顺序将各种氨基酸连接成特定的氨基酸序列(translation)最终得到基因的表达产物（蛋白质）。第5页,共57页，2024年2月25日，星期天第一节基因表达的基本条件1、基因表达的基本过程2、有效转录的基本条件3、正确翻译的基本条件4、影响克隆基因表达效率的因素第6页,共57页，2024年2月25日，星期天Transcription(转录):

makinganRNAcopyofaDNAsequence.RNApolymeraseopensthepartoftheDNAtobetranscribed.OnlyonestrandofDNA(thetemplatestrand,antisensestrand)istranscribed.

转录的具体过程第7页,共57页，2024年2月25日，星期天转录的具体过程Antisensestrand第8页,共57页，2024年2月25日，星期天有效转录的基本条件Groupsofgenescodingforrelatedproteinsarearrangedinunitsknownasoperons.Anoperonconsistsofanoperator,promoter,regulator,andstructuralgenes.Theregulatorgenecodesforarepressorproteinthatbindstotheoperator,obstructingthepromoterofthestructuralgenes.Theregulatordoesnothavetobeadjacenttoothergenesintheoperon.Iftherepressorproteinisremoved,transcriptionmayoccur.半乳糖苷酶渗透酶转乙酰基酶第9页,共57页，2024年2月25日，星期天第10页,共57页，2024年2月25日，星期天Operonsareeitherinducibleorrepressibleaccordingtothecontrolmechanism.Seventy-fivedifferentoperonscontrolling250structuralgeneshavebeenidentifiedforE.coli.Bothrepressionandinductionareexamplesofnegativecontrolsincetherepressorproteinsturnofftranscription.第11页,共57页，2024年2月25日，星期天第12页,共57页，2024年2月25日，星期天

启动子（promoter）：在基因序列中，标志着转录起始的可被RNA聚合酶识别的位点(DNA区段)，一般位于基因的上游。

终止子（terminator）：位于基因的编码序列之外（一般在下游）的一段标志着转录停止的RNA聚合酶识别位点。有效转录的基本条件Prokaryoticgeneregulationdiffersfromeukaryoticregulation,butsinceprokaryotesaremucheasiertoworkwith,wefocusonprokaryotesatthispoint.

PromotersaresequencesofDNAthatarethestartsignalsforthetranscriptionofmRNA.Terminatorsarethestopsignals.mRNAmoleculesarelong(500-10,000nucleotides).

第13页,共57页，2024年2月25日，星期天第一节基因表达的基本条件1、基因表达的基本过程2、有效转录的基本条件3、正确翻译的基本条件4、影响克隆基因表达效率的因素第14页,共57页，2024年2月25日，星期天TheGeneticCodeTocodeforthe20essentialaminoacidsageneticcodemustconsistofatleasta3-baseset(triplet)ofthe4bases.Ifoneconsidersthepossibilitiesofarrangingfourthings3atatime(4X4X4),weget64possiblecodewords,orcodons(a3-basesequenceonthemRNAthatcodesforeitheraspecificaminoacidoracontrolword).ThegeneticcodewasbrokenbyMarshallNirenbergandHeinrichMatthaei,adecadeafterWatsonandCrick'swork.Thegeneticcodeconsistsof61amino-acidcodingcodonsandthreeterminationcodons,whichstoptheprocessoftranslation.Thegeneticcodeisthusredundant(degenerateinthesenseofhavingmultiplestatesamountingtothesamething),with,forexample,glycinecodedforbyGGU,GGC,GGA,andGGGcodons.正确翻译的基本条件第15页,共57页，2024年2月25日，星期天Thegeneticcode第16页,共57页，2024年2月25日，星期天MessengerRNA(mRNA)istheblueprintforconstructionofaprotein.TransferRNA(tRNA)isthetruckdeliveringtheproperaminoacidtothesiteattherighttime.tRNAwillforma"cloverleaf"structureduetocomplementarybasepairing.Atthetopofthelargelooparethreebases,theanticodon,whichisthecomplementofthecodon.Thereare61differenttRNAs,eachhavingadifferentbindingsitefortheaminoacidandadifferentanticodon.第17页,共57页，2024年2月25日，星期天Ribosomesaretheorganelle(inallcells)whereproteinsaresynthesized.Theyconsistoftwo-thirdsrRNAandone-thirdprotein.Ribosomesconsistofasmall(inE.coli,30S)andlarger(50S)subunits.ThelengthofrRNAdiffersin

each.The30Sunithas16SrRNAand21differentproteins.The50Ssubunitconsistsof5Sand23SrRNAand34differentproteins.ThesmallersubunithasabindingsiteforthemRNA.

ThelargersubunithastwobindingsitesfortRNA第18页,共57页，2024年2月25日，星期天TranslationistheprocessofconvertingthemRNAcodonsequencesintoanaminoacidsequence.Theinitiatorcodon(AUG)codesfortheaminoacidN-formylmethionine(f-Met).NotranslationoccurswithouttheAUGcodon.f-Metisalwaysthefirstaminoacidinapolypeptidechain,althoughfrequentlyitisremovedaftertranslation.TheintitatortRNA/mRNA/smallribosomalunitiscalledtheinitiationcomplex.Thelargersubunitattachestotheinitiationcomplex.Aftertheinitiationphasethemessagegetslongerduringtheelongationphase.第19页,共57页，2024年2月25日，星期天NewtRNAsbringtheiraminoacidstotheopenbindingsiteontheribosome/mRNAcomplex,formingapeptidebondbetweentheaminoacids.ThecomplexthenshiftsalongthemRNAtothenexttriplet,openingtheAsite.ThenewtRNAentersattheAsite.WhenthecodonintheAsiteisaterminationcodon,areleasingfactorbindstothesite,stoppingtranslationandreleasingtheribosomalcomplexandmRNA.Oftenmanyribosomeswillreadthesamemessage,astructureknownasapolysomeforms.Inthiswayacellmayrapidlymakemanyproteins.第20页,共57页，2024年2月25日，星期天正确翻译的基本条件1、具备起始密码子2、具备终止密码子3、具有正确的阅读框第21页,共57页，2024年2月25日，星期天基因表达的基本过程第22页,共57页，2024年2月25日，星期天第一节基因表达的基本条件1、基因表达的基本过程2、有效转录的基本条件3、正确翻译的基本条件4、影响克隆基因表达效率的因素第23页,共57页，2024年2月25日，星期天4、影响克隆基因表达效率的因素

一般而言，所用启动子的强度、DNA的转录其始序列、密码子的选择、mRNA的二级结构、转录的终止、基因的拷贝数等都会在一定程度上影响到转基因的表达。启动子的结构对表达效率的影响大多数大肠杆菌启动子都含有两种保守区,即-10区(位于转录其始位点上游5-10bp，故称为-10区，序列为5’--TTGACA)和-35区(位于转录起始位点上游25bp处，一般有10bp组成，故称为-35区，5’--TATAAT)。当然，实际的启动子中很少具备与上述序列完全一致的区域，但是研究表明，启动子的这两个区域与上述保守序列的相似程度越高，该启动子的表达能力也就越强。另外，这两个保守区间的距离也是影响启动子强度的重要因素，即这个间距越是接近于17bp，启动子的活性就越强。第24页,共57页，2024年2月25日，星期天b.翻译起始序列对表达效率的影响

mRNA的有效翻译依赖于核糖体和其的稳定结合，大肠杆菌的mRNA序列中，核糖体的结合位点是起始密码子AUG和其上游的SD序列。所谓SD序列就是由Shine-Dalgarno首先提出的一种位于位于起始密码子上游的一段保守序列，为细菌核糖体有效结合和翻译起始所必需。一般SD序列的长度约为3-9bp，位于起始密码子上游3-11碱基的位置，它与16S核糖体RNA的3‘端互补，控制了翻译的起始。５’--AGGAGGUXXXAUG---mRNA３’AUUCCUCCACUAG-----

16SrRNA3’末端第25页,共57页，2024年2月25日，星期天c.启动子与克隆基因间的距离对基因表达的影响

研究表明启动子和目的基因间的距离对基因的表达效率影响很大，所以在构建新的表达载体时要考虑到这仪因素的影响。另外，在克隆基因的末端要就近插入有效的终止子序列，否则会导致细胞能量的大量消耗，或是形成不应有的二级结构，最终影响的目的基因的表达效率。PromoterSDATGGeneTerminatorTAAmRNA第26页,共57页，2024年2月25日，星期天第五章克隆基因的表达第一节基因表达的基本条件第二节原核表达载体的构建第三节克隆基因在植物细胞中的表达第27页,共57页，2024年2月25日，星期天第二节原核表达载体的构建一、原核表达真核基因的困难二、构建原核表达载体的策略三、常用于原核表达载体的启动子第28页,共57页，2024年2月25日，星期天一、原核表达真核基因的困难细菌的RNA聚合酶不识别真核基因的启动子；真核基因转录的mRNA缺乏SD序列，在原核细胞中不能结合到核糖体上；真核基因一般含有内含子，而原核细胞没有象真核细胞那样的转录后加工系统，所以mRNA中的内含子部分不能被切除，不能形成成熟的RNA，也就不能表达出有功能的真核蛋白；表达的真核蛋白在原核细胞中很不稳定，容易被细菌蛋白酶降解破坏。第29页,共57页，2024年2月25日，星期天二、构建原核表达载体的策略将真核基因克隆到一个强大的原核启动子和SD序列的下游，使得真核基因处于原核调控体系中。采用真核基因的cDNA序列作为构建表达载体的目的基因，这样就解决了原核细胞没有RNA剪接功能的问题。构建载体时，将真核基因插在几个原核密码子的后面，翻译后就得到了原核多肽和真核多肽的融合蛋白，这样就可以避免被原核蛋白酶的识别和降解，最后可以将融合多肽切除。第30页,共57页，2024年2月25日，星期天三、常用于原核表达的启动子Lac启动子是β-半乳糖苷酶编码基因LacZ的转录的调控序列，该启动子可以被IPTG诱导，所以在培养基中加入该安慰诱导物就可以诱导目的基因的表达。Trp启动子是编码参与色氨酸生物合成的几种酶的基因簇的上游调控序列，可以被色氨酸抑制，但可以被β-吲哚丙烯酸（β-

IAA）诱导。Tac启动子是一种由Lac和Trp启动子杂合而成的启动子，其强度得到了很大的提高，也可被IPTG诱导表达。λPL启动子是负责λDNA分子转录的启动子之一，是一种极强的启动子。第31页,共57页，2024年2月25日，星期天第五章克隆基因的表达第一节基因表达的基本条件第二节原核表达载体的构建第三节克隆基因在植物细胞中的表达第32页,共57页，2024年2月25日，星期天第三节克隆基因在植物细胞中的表达一、真核基因表达的特点二、用于植物表达的启动子类型三、Ti质粒及农杆菌介导的植物遗传转化第33页,共57页，2024年2月25日，星期天真核基因表达的特点一条成熟的mRNA只能翻译成一条多肽，不存在象原核生物那样的多基因操纵子模式；基因转录调节区很大，而且往往远离启动子达几百个甚至上千个碱基，它们并不直接影响RNA聚合酶与启动子区的结合，而是通过改变基因5’上游区DNA的构型来影响RNA聚合酶与启动子区的结合；mRNA合成后穿过核膜进入细胞质中后才进行翻译工作，而且通常都有复杂的成熟和剪接过程；基因的启动子区和原核基因差异很大，而且有增强子序列存在。第34页,共57页，2024年2月25日，星期天真核基因转录起始位点上游序列的特点

特点起始位点上游调控区其它调控区

原核生物嘌呤和嘧啶都能起始转录范围小，-10区，-30到-70区为正调控区，+10到-20区为负调控区；有TTGACA区(-30~-40）参与调控。

真核生物有“帽子”结构专一性（嘧啶腺苷酸嘧啶），只有嘌呤（A为主）才能起始转录范围大，TATAA/TA区位于-20到-30，-40到-110区为上游激活区；除了有对应的CAAT区外，还有GC区和增强子。第35页,共57页，2024年2月25日，星期天基因转录起始位点上游序列的比较TTGACATATAATPu>Py-35区-30-70正调控区-20负调控区+1-10区GC区….CAAT区TATAAATPuAPy-40-110+1-20-30增强子CCGCCC或GGGCGG或GGCCAATCTTA原核真核第36页,共57页，2024年2月25日，星期天第三节克隆基因在植物细胞中的表达一、真核基因表达的特点二、用于植物表达的启动子类型三、Ti质粒及农杆菌介导的植物遗传转化第37页,共57页，2024年2月25日，星期天驱动转基因表达的启动子类型天然诱导型启动子组织特异性表达诱导型表达化学诱导型调控体系组织特异型启动子组成型表达花椰采花叶病毒(CaMV)

35S启动子水稻肌动蛋白1(actin1)act1启动子

第38页,共57页，2024年2月25日，星期天表达组织启动子来源目的植物作者花药烟草Ta29烟草油菜Mariani（1990）种子菜豆植物凝集素基因PHA-LtobaccoAltabella（1990）叶片PEPC（PepcarboxylaseGeneofMaize）maizeKozial（1993）韧皮部水稻蔗糖合酶基因RSs1tobaccoShi（1994）果实ovarytissue（patent）tomatoMartineau（1995）胚乳玉米淀粉合酶基因GBSmaizeRussell（1997）根系发根农杆菌的rolD启动子番茄Varvara（2001）髓部玉米pGL2riceDatta（1998）部分用于植物遗传转化的组织特异性启动子第39页,共57页，2024年2月25日，星期天RSuS1启动子的组织特异性表达35S-GusRSP1/2-Gus第40页,共57页，2024年2月25日，星期天

化学诱导型调控系统是指可被某些化学物质诱导而表达启动或表达关闭的转基因调控系统。和植物天然的诱导型启动子相比，该类系统的应用更加灵活和自由，人们可以根据需求在转基因作物生长的任何时期对转基因的表达进行调控。作为理想的化学诱导物必须具备以下特性：第一，化学诱导物要对转基因诱导的专一性高，在受体作物中其本身含量低且对受体作物无毒害作用；第二，对环境友好，且造价不高；第三，诱导效率要高，其工作浓度低且不是常用的化学物质；第四，方便于喷洒或蘸根处理。

化学诱导型表达调控系统的原理第41页,共57页，2024年2月25日，星期天用于转基因表达诱导物的分子式Moleculesusedforthechemicalinductionoftransgeneexpressioninplants.TetracyclineDexamethasoneEthanolRH-5992第42页,共57页，2024年2月25日，星期天化学诱导型表达调控系统的原理

一般来说，化学诱导调控系统都包含两个转录单元。第一个转录单元由一个组成型启动子（通常为35S启动子）驱动一个对特定化学成分敏感的转录调控因子构成；第二个转录单元由多拷贝的转录因子结合位点、微型植物启动子（通常为截短的35S启动子）和目的基因串联而成。第43页,共57页，2024年2月25日，星期天A去抑制型B失活型第44页,共57页，2024年2月25日，星期天第三节克隆基因在植物细胞中的表达一、真核基因表达的特点二、用于植物表达的启动子类型三、Ti质粒及农杆菌介导的植物遗传转化第45页,共57页，2024年2月25日，星期天

人们很早就发现双子叶植物常发生一种冠瘿瘤病，该病在法国、东欧和意大利的葡萄和果树上曾大面积发生。1907年Smith和Townsent等首先发现这种冠瘿瘤病是由根癌农杆菌引发的。农杆菌的Ti质粒与植物遗传转化第46页,共57页，2024年2月25日，星期天农杆菌的Ti质粒与植物遗传转化1974年Zaenen等在根癌农杆菌内发现并分离了一种与肿瘤诱导有关的大型质粒（大于200kb），称为Ti质粒。1977年Chilton等在研究农杆菌侵染后形成的植物肿瘤细胞时，用分子杂交发现在肿瘤细胞中存在着农杆菌Ti质粒的一个片段，称为T-DNA（Transfer-DNA）。实验表明，T-DNA转移到植物细胞后整合进植物基因组中并得以表达，从而导致了冠瘿瘤的发生。进一步研究发现，整合到植物基因组中的T-DNA可以通过减数分裂稳定地传给植物的后代，Ti质粒的上述特性成为农杆菌介导法植物遗传转化的重要基础。第47页,共57页，2024年2月25日，星期天Ti质粒为根癌农杆菌核外的一种环状双链DNA分子，长约200Kb。其中含有一段称为T-DNA的可转移区段，当农杆菌侵染寄主细胞后，T-DNA可以从农杆菌转移