整个基因克隆实验作业流程完整

组织总RNA提取相关试剂：Trizol；氯仿；苯酚；异丙醇；75%乙醇；RNase-free水相关仪器：制冰机；液氮&研钵/生物样品研磨仪；高速离心机；移液器（1ml、200μl、100μl/50μl）；涡旋振荡仪；恒温金属浴。相关耗材：解剖工具，冰盒，离心管，离心管架，吸头（1ml，200μl/300μl），一次性手套，试验手套。试验步骤取暂养草鱼，冰上放置一段时间，然后解剖，剪取肠道50~100mg，放入研钵中，加入液氮快速研磨，然后加入1ml预冷TRIzol试剂，充足研磨至无颗粒物存在。转移到离心管中，室温放置5min，使细胞充足裂解；按1mlTrizol加入200μl氯仿，盖上盖子，快速充足摇匀15s，然后室温放置3min；4℃，,1g此时混合物分为三层，下层红色苯酚氯仿层，中间层和上层无色水相；RNA存在于无色水相中；小心吸收上清液，千万不要吸收中间界面，不然有DNA污染；转移至一个新离心管，加入等体积异丙醇，轻轻混匀；室温放置10min；4℃，,1g离心10min；弃上清，加入1ml75%乙醇洗涤；涡旋，悬浮沉淀；4℃，,1g离心5min；弃上清；能够再次用75%乙醇洗涤沉淀；弃上清；用移液器轻轻吸收管壁或管底残余乙醇，注意不要吸收沉淀；室温放置5min晾干沉淀；（RNA样品不要过于干燥，不然极难溶解）沉淀中加入30μlRNase-free水，轻弹管壁，使RNA溶解。RNA质量检测相关试剂：溴酚蓝，TEB/TAE电泳缓冲液，溴乙锭（EB）相关仪器：（超微量分光光度计，移液器（2.5μl或2μl规格，10μl规格），电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，制冰机）相关耗材：（无菌无绒纸，吸头，离心管架，PCR管，PCR管架，锥形瓶，烧杯，一次性手套，试验手套，冰盒）（1）RNA纯度检测：测定其OD260和OD280值，依据其OD260/OD280比值，当其比值在1.9~2.1之间，说明提取总RNA纯度比较高，没有蛋白质和基因组污染。（2）RNA完整性检测：取2μlRNA，和2μl溴酚蓝混匀，用1%琼脂糖进行凝胶电泳，20min后，在凝胶成像系统中观察效果。当28S和18S条带清楚，且亮度比大约是2:1时，5S条带若隐若现，而且没有其它条带时，说明完整性不错，能够用于下游逆转录试验。逆转录（RNA逆转录成cDNA）相关仪器：（PCR仪/恒温金属浴，移液器（2.5μl或2μl规格，10μl规格），100μl冰盒，制冰机，PCR管）依据逆转录试剂盒（TOYOBO企业）说明书进行，反应体系及条件以下：试剂使用量（μl）RnaseFreeH2O11.75-YOligo（dT）1TotalRNA（<1000ng）YTotalVolume12.7565℃试剂使用量（μl）上一步变性后RNA溶液12.755×RTBuffer4dNTPMixture（各10mM）2RnaseInhibitor（10U/μl）0.25ReverTraAce1TotalVolume20然后放置于PCR仪上，反应程序为：42℃,60min；99℃,5min；16℃,5min。所得cDNA放置于-20℃保留。PCR反应相关仪器：（PCR仪/恒温金属浴，移液器（2.5μl或2μl规格，10μl规格），100μl电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，冰盒，制冰机）试剂使用量（μl）ddH2O6.0反转录产物1.010×PCRBuffer1.0dNTP（10mmol/l）0.2Taq酶（1U/μl）0.4Ghrelin-F（10μmol/l）0.4Ghrelin-R（10μmol/l）0.4MgCl2（25mmol/l）0.6TotalVolume10反应条件：95℃,预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸10min。反应结束后，取5μlPCR产物，1%琼脂糖凝胶电泳检测。

PCR产物分离，回收和纯化相关试剂：胶回收试剂盒相关仪器：（紫外照胶仪，移液器（200μl，1ml规格），离心机，恒温金属浴，涡旋混匀仪，制冰机，超微量分光光度计）相关耗材：（切胶刀片，吸头，离心管架）PCR反应得到目标条带后，加大反应体积，然后依据胶回收试剂盒说明书进行目标片段回收纯化。将所得DNA贮存于-20℃目标片段和载体连接相关仪器：（恒温金属浴，移液器（10μl，2.5μl规格）涡旋混匀仪，制冰机）根据连接试剂盒(TAKARA企业)说明书进行操作。pMD-18T载体1μlDNA 2μlddH2O 2μl然后加入5μlLigationMix，4℃/16℃放置过夜连接。转化相关仪器：（超净工作台，离心机，恒温培养箱，恒温摇床，恒温金属浴/水浴锅，移液器（1000μl，100μl，10μl，2.5μl规格）涡旋混匀仪，制冰机）CaCl2法制备大肠杆菌DH5a感受态细胞全过程冰上进行，4℃离心，无菌操作。（1）以接种环从-80℃保留高效转化菌种蘸取少许菌液划无抗生素平板，培养12h；（2）挑取单菌落接种于1ml无抗生素LB培养基中，37℃猛烈震荡培养6h；（3）按1:100接种菌液于25mlLB液体培养基中，37℃震荡培养1.5～2h，至OD600达0.4～0.6；（这一步很关键，培养过分菌液含有较多“老”细胞，制备成感受态细胞后其接收外援DNA能力较低，从而造成转化率降低）（4）冰上预冷10min；然后4℃，6000rpm离心10min；（6）弃上清，将细菌沉淀重新悬浮于25ml预冷0.1MCaCl2中，冰浴20min；（7）4℃，6000rpm离心10min，弃尽上清；（8）以1.25ml（菌液体积5%）预冷0.1MCaCl2溶液重悬细菌沉淀，同时加入0.3ml预冷100%甘油（甘油终浓度达15～20%），混匀后按每支100μl在冰上分装。-80℃保留备用。连接产物转化到感受态细胞（1）将10μl连接产物加入100μl感受态菌液中，冰上放置30min；（2）然后放到42℃水浴锅中热激90s，再在冰上放置3min；（3）加入890μlLB液体培养基，37℃震荡培养60min；（4）每个培养平板中加入40μlX-gal和4μlIPTG，然后吸收100μl菌液，均匀涂布于含AmpLB固体培养基平板上；（5）37℃培养箱中正放1h，待菌液被琼脂完全吸干后，倒置平板，过夜培养16h。（培养时间不宜过长，不然有卫星菌落产生）菌液PCR检测相关仪器：（PCR仪/恒温金属浴，涡旋混匀仪，移液器（10规格，1000μl规格），100μl电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，冰盒，制冰机）在平板上挑取10～20个白色菌落，加入含有1mlAmp+LB液体培养基1.5ml离心管中，37℃震荡培养6h。3000rpm离心3min后吸掉上层400μ附注：关键溶液和培养基配制1）电泳缓冲液10×TBE：108gTris碱，55g硼酸，20ml0.5MEDTA，加入蒸馏水混匀后定容至1000ml，调整pH为8.0；2）LB液体培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g；加800ml去离子水，用10MNaOH调整pH至7.0，定容至1000ml，高压（1.034×100000Pa）灭菌20min，4℃3）LB固体培养基：在LB液体培养基中加入琼脂粉至终浓度为1.5%，高温、高压灭菌20min后降温至50~60℃，在无菌状态下铺制平板，室温放置过夜后，置于44）氨苄青霉素贮存液：用无菌双蒸水配成100mg/ml，分装，-20℃5）用于制备感受态细胞CaCl2（0.1mol/l）：称取0.56gCaCl2（无水，分析纯），溶解于50ml双蒸水中，定容至100ml，高压灭菌；6）X-gal（20mg/ml）配制：将20mgX-gal溶于1ml二甲基甲酰胺中，-20℃7）IPTG（200mg/ml）配制：将0.2gIPTG溶于1ml去离子双蒸水中，0.22μm滤膜除菌，-20℃

3’RACE（dT）17-接头引物：5’GACTCGAGTCGACATCGA(T)173’接头引物：5’GACTCGAGTCGACATCG3’cDNA合成DEPC水9.75μlOligodT接头引物1μlTotalRNA2μl(<1000ng)65℃,5min；立即置于冰上。第一步变性后RNA溶液12.75μl5×RTBuffer4μldNTPMixture（各10mM）2μlRnaseInhibitor（40U/μl）0.25μlReverTraAce1μl总体积20μl反应条件：42℃,60min；99℃,5min；16℃,5min。cDNA纯化利用胶回收试剂盒进行（去除多出dNTP和引物）。最终使用20μlTE洗脱沉淀。第一轮PCRcDNA1μl10×Buffer1μldNTP（10mmol/L）0.2μlOligodT接头引物(10μmol/L)0.4μl3’RACE外引物(10μmol/L0.4μlTaq酶(1U/μl)0.4μlMgCl2（25mmol/L）0.6μlddH2O6.0μl反应条件：降落PCR。PCR产物稀释10倍作为模板进行下游试验。第二轮PCRcDNA1μl10×Buffer1μldNTP（10mmol/L）0.2μl接头引物(10μmol/L)0.4μl3’RACE内引物(10μmol/L0.4μlTaq酶(1U/μl)0.4μlMgCl2（25mmol/L）0.6μlddH2O6.0μl反应条件：降落PCR。

5’RACEcDNA合成DEPC水9.75μl基因特异性反义引物1μlTotalRNA2μl(<1000ng)65℃,5min；立即置于冰上。第一步变性后RNA溶液12.75μl5×RTBuffer4μldNTPMixture（各10mM）2μlRnaseInhibitor（40U/μl）0.25μlReverTraAce1μl总体积20μl反应条件：42℃,60min；99℃,5min；16℃,5min。cDNA纯化利用胶回收试剂盒进行（去除多出dNTP和引物）。最终使用20μlTE洗脱沉淀。cDNA加尾纯化后cDNA5.7μl5×末端转移酶缓冲液2μl1mmol/ldATP2μl末端转移酶（30U/μl）0.3μl总体积10μl反应条件：37℃,60min；70℃，10min。反应结束，把cDNA稀释1倍作模板进行下游试验。第一轮PCRcDNA1μl10×Buffer1μldNTP（10mmol/L）0.2μlOligodT接头引物(10μmol/L)0.4μl5’RACE外引物(10