生物分离工程发酵液预处理

关于生物分离工程发酵液预处理两个问题1、为什么要进行发酵液的预处理?不仅在于分离菌体和其他悬浮颗粒，还着眼于除去部分可溶性杂质和改变滤液的性质，以利于提取和精制后继各工序的顺利进行。2、如何选择合适的预处理方法?各种发酵产品，由于菌种不同和发酵液特性不同，其预处理方法的选择也有不同。大多数发酵产物存在于发酵液中，也有少数产物存在于菌体中，或发酵液和菌体中都含有。对于胞内产物，经预处理应尽可能使目的产物转移到液相，然后经固液分离除去固相；对于胞内产物，则应首先收集菌体或细胞，经细胞破碎后，目的产物进入液相，随后再将细胞碎片分离。第2页,共61页，2024年2月25日，星期天第一节发酵液过滤特性的改变第3页,共61页，2024年2月25日，星期天发酵液的特性特性：⑴发酵产物浓度较低，大多为1~10%，悬浮液中大部分是水；⑵悬浮物颗粒小，相对密度与液相相差不大；⑶固体粒子可压缩性大；⑷液相粘度大，大多为非牛顿型流体；⑸性质不稳定，随时间变化，如易受空气氧化、微生物污染、蛋白酶水解等作用的影响。这些特性，使得发酵液的过滤与分离相当困难。物理化学方法第4页,共61页，2024年2月25日，星期天一、降低液体粘度常用方法：（1）加水稀释法：有效（稀释后过滤速率提高的百分比必须大于加水比才能认为有效）（2）加热法：同时，在适当温度和受热时间下使蛋白质凝聚，进一步改善了过滤特性。严格控制加热温度与时间第5页,共61页，2024年2月25日，星期天二、调整PH等电点法对某一具体的单元操作的作用：改变大分子物质的电荷特性，减少堵塞和污染，如膜过滤。一些物质（如细胞、细胞碎片、胶休物质等）在某个PH下也可能趋于絮凝，有利于过滤进行。第6页,共61页，2024年2月25日，星期天三、凝聚与絮凝凝聚与絮凝其处理过程就是将化学药剂预先投加到悬浮液中，改变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，破坏其稳定性，使它们聚集成可分离的絮凝体，再进行分离。1、概念上的差别凝聚是指在电解质的作用下，由于胶粒之间双电层排斥作用降低，电位下降，而使胶体体系不稳定的现象。絮凝则是指在某些絮凝剂存在下，基于桥架作用，使胶粒形成较大絮凝团的过程。第7页,共61页，2024年2月25日，星期天2、凝聚胶体粒子(10-100nm)中性盐促进下脱稳相互聚集成大粒子（1mm）机理：（1）中和粒子表面电荷（2）消除双电层结构发酵液的带电现象发酵液中的细胞、菌体或蛋白质等胶体粒子的表面，一般都带有电荷，带电的原因很多，主要是吸附溶液中的离子或自身基团的电离。第8页,共61页，2024年2月25日，星期天发酵液的带电现象——双电层结构通常发酵液中细胞或菌体带有负电荷，由于静电引力的作用使溶液中带相反电荷的粒于（即正离子）被吸附在其周围，在界面上形成了双电层。但是这些正离子还受到使它们均匀分布开去的热运动的影响，具有离开胶粒表面的趋势，在这两种相反作用的影响下，双电层就分裂成两部分，在相距胶核表面约一个离子半径的平面以内，正离子被紧密束缚在胶核表面，称为吸附层或stern层；在stern平面以外，剩余的正离子则在溶液中扩散开去，距离越远，浓度越小，最后达到主体溶液的平均浓度，称为扩散层。这样就形成了扩散双电层的结构模型。第9页,共61页，2024年2月25日，星期天胶体双电层结构第10页,共61页，2024年2月25日，星期天凝聚值或凝聚价在发酵液中加入具有高价阳离子的电解质，由于能降低双电层电位和脱除胶粒表面的水化膜，就能导致胶粒间的凝聚作用。电解质的凝聚能力可用凝聚值或凝聚价来表示，使胶粒发生凝聚作用的最小电解质浓度（mmol/L），称为凝聚值或凝聚价。第11页,共61页，2024年2月25日，星期天Schulze-Hardy法则——叔米-哈第法则反离子的价数越高，该值就越小，即凝聚能力越强。阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力的次序为A13＋＞Fe3+

＞H＋＞Ca2十＞Mg2+＞K+＞Na+＞Li+，常用的凝聚剂电解质有：Al2(SO4)3·18H20（明矾）；AlC13·6H2O；FeC13；ZnSO4；MgCO3等。第12页,共61页，2024年2月25日，星期天3、絮凝大分子絮凝剂将胶体粒子交联成网状，形成絮凝团的过程。机理：架桥作用。絮凝剂通过静电引力、范德华力或氢键的作用，强烈地吸附在胶粒的表面。当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的胶粒表面上，产生桥架联接时，就形成了较大的絮团，这就是絮凝作用。第13页,共61页，2024年2月25日，星期天高分子絮凝剂的吸附架桥作用第14页,共61页，2024年2月25日，星期天常用的絮凝剂聚丙烯酰胺（po1yacry1amide）类和聚乙烯亚胺（polyethyleneimine）衍生物，根据活性基团在水中解离情况不同，可分为非离子型、阴离子型（含有羧基）和阳离子型（含有胺基）三类。由于聚丙烯酰胺类絮凝剂具有用量少，一般以ppm计量，絮凝体粗大，分离效果好，絮凝速度快以及种类多等优点，所以适用范围广。聚丙烯酸类阴离子絮凝剂和聚苯乙烯类衍生物。无机高分子聚合物也是较好的一类絮凝剂，如聚合铝盐和聚合铁盐等。第15页,共61页，2024年2月25日，星期天常用的絮凝剂天然有机高分子絮凝剂，如壳聚糖和葡聚糖等聚糖类，还有明胶、骨胶、海藻酸钠等。微生物絮凝剂是近年来研究和开发的新型絮凝剂，它是一类由微生物产生的具有絮凝细胞功能的物质。主要成分是糖蛋白、粘多糖、纤维素及核酸等高分子物质。微生物絮凝剂和天然絮凝剂与化学合成的絮凝剂相比，最大的优点是安全，无毒和不污染环境。第16页,共61页，2024年2月25日，星期天絮凝剂应用优化用量控制：最佳用量为粒子表面积约有一半被聚合物覆盖时所用的絮凝剂量。pH控制固体浓度与粒子尺寸分布电解质含量后续工艺要求第17页,共61页，2024年2月25日，星期天凝聚和絮凝在发酵液预处理中的应用凝聚和絮凝技术能有效的改变细胞菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，使其聚集起来，增大体积以便固液分离，常用于菌体细小而且黏度大的发酵液的预处理中。第18页,共61页，2024年2月25日，星期天四、加入助滤剂1、助滤剂及其作用：最常用的——硅藻土2、使用方法：两种（1）在过滤介质表面预涂助滤剂（2）直接加入发酵液也可两种方法同时兼用3、选择及使用要点（1）根据目的产物选择助滤剂品种（2）根据过滤介质和过滤情况选择助滤剂品种（3）粒度选择：必须与悬浮液中固体粒子的尺寸相适应（4）使用量的选择：合适第19页,共61页，2024年2月25日，星期天五、加入反应剂不影响目的产物作用机理：加入反应剂和某些可溶性盐类发生反应生成不溶性沉淀，生成的沉淀能防止菌丝体粘结，使菌丝具有块状结构，沉淀本身可作为助滤剂，并且能使胶状物和悬浮物凝固，从而改善过滤性能。正确选择反应剂和反应条件，能使过滤速率提高3~10倍。第20页,共61页，2024年2月25日，星期天第二节发酵液的相对纯化为什么要纯化？对于不同的杂质，要选择不同的方法。第21页,共61页，2024年2月25日，星期天一、高价无机离子的除去发酵液中主要的无机离子有Ca2+，Mg2+，Fe3+

1、Ca2+

的除去为了去除钙离子，宜加入草酸。但草酸溶解度较小，故用量大时，可用其可溶性盐，如草酸钠。反应生成的草酸钙还能促使蛋白质凝固，提高滤液（也称为原液）质量。但草酸价格较贵，应注意回收。如四环类抗生素废液中，加入硫酸铅，在60℃下反应生成草酸铅。后者在90~95℃下用硫酸分解，经过滤、冷却、结晶后可以回收草酸。第22页,共61页，2024年2月25日，星期天2、Mg2+，Fe3+

的除去草酸镁的溶解度较大，故加入草酸不能除尽镁离子。要除去镁离子，可以加入三聚磷酸钠Na5P3O10，它和镁离子形成可溶性络合物：Na5P3O10

＋Mg2+→MgNa3P3O10

＋2Na+

用磷酸盐处理，也能大大降低钙离子和镁离子的浓度。要除去铁离子，可加入黄血盐，使形成普鲁士蓝沉淀:4Fe3++3K4Fe(CN)6→Fe4[Fe(CN)6]3↓+12K+第23页,共61页，2024年2月25日，星期天二、杂蛋白质的除去前面介绍的方法，在改善发酵液过滤特性的同时，也除去了一部分杂蛋白质。下面再介绍几种常用的方法：（1）沉淀法：等电点沉淀法蛋白质一般以胶体状态存在于发酵液中，胶体粒子的稳定性和其所带电荷有关。和氨基酸等两性物质一样，蛋白质在酸性溶液中带正电荷，在碱性溶液中带负电荷，而在某一pH下，净电荷为零，溶解度最小，可使其产生沉淀而除去，称为等电点沉淀法。第24页,共61页，2024年2月25日，星期天（2）变性法：蛋白质从有规则的排列变成不规则结构的过程称为变性。变性蛋白质溶解度较小。最常用的使蛋白质变性的方法是加热。加热还能使液体粘度降低，加快过滤速度。柠檬酸发酵液，采用加热至80℃以上，使蛋白质变性凝固和降低发酵液粘度，从而大大提高了过滤速度。变性的其它方法：大幅度调节PH，加有机溶剂链霉素生产中，采用调pH至酸性（pH3.0），加热至70℃，维持半个小时的方法来去除蛋白质，能使过滤速度增大10-100倍，滤液粘度可降低1/6。注意：加热法只适合对热稳定的目的产物；极端PH会导致某些目的产物失活，且消耗大量酸碱；而有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合。第25页,共61页，2024年2月25日，星期天（3）吸附法利用吸附作用也可除去蛋白质。四环类抗生素生产中，采用黄血盐和硫酸锌的协同作用生成亚铁氰化锌钾K2Zn3[Fe(CN)5]2的胶状沉淀来吸附蛋白质，利用此法除蛋白质已取得很好的效果。在枯草杆菌发酵液中，常加入氯化钙和磷酸氢二钠，这两者本身生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及其它不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去，从而加快了过滤速度。第26页,共61页，2024年2月25日，星期天第三节固液分离工程

本节介绍细胞分离、目标产物释放以及蛋白质复性的各种主要方法。第27页,共61页，2024年2月25日，星期天固液分离的目的和方法包括两方面：收集胞内产物的细胞或菌体，分离除去液相，或者是收集含生化物质的液相，分离除去固体悬浮物，如细胞、菌体、细胞碎片、蛋白质的沉淀物和它们的絮凝体等。常用的方法：过滤和离心分离等化工单元操作。第28页,共61页，2024年2月25日，星期天一、重力沉降虽然简便易行，但速度很慢。可先用凝聚或絮凝技术使颗粒变大，再使用。使用场合有限第29页,共61页，2024年2月25日，星期天二、离心分离借助离心机旋转所产生的离心力，使不同大小和不同密度的物质分离的技术。最广泛使用的非均相分离手段，细胞的收集、细胞碎片和沉淀的分离等常用离心分离。超速离心技术已成为分离、纯化、鉴别和各种生物大分子的重要手段之一第30页,共61页，2024年2月25日，星期天1、沉降系数S单位离心力作用下粒子的沉降速度，以Svedberg表示，简称S。1S=1×10-13s离心沉降速度沉降速度是指在强大离心力作用下，单位时间内物质运动的距离。是离心设备的一个重要技术指标，是其所能达到的离心力与重力的比值。第31页,共61页，2024年2月25日，星期天2、离心力离心力(Centrifugalforce)：离心力作为真实的力根本就不存在，在非惯性系中为计算方便假想的一个力。相对离心力（Relativecentrifugalforce，RCF）：通常离心力常用地球引力的倍数来表示，指在离心场中，作用于颗粒的离心力相当于地球重力的倍数，单位是重力加速度“g”。

注：n(rpm)应折换成转/秒一般情况下，低速离心时常以转速“rpm”来表示，高速离心时则以“g”表示。第32页,共61页，2024年2月25日，星期天3、离心机的种类与用途按转速分：常速（低速）、高速和超速（1）、常速离心机<8000r/min，RCF<1×104g用途：分离细胞、细胞碎片、培养基残渣及粗结晶等较大颗粒（2）、高速离心机1×104g～2.5×104r/min，RCF1×104g～105g用途：分离各种沉淀物、细胞碎片及较大的细胞器等高速冷冻离心机第33页,共61页，2024年2月25日，星期天（3）、超速离心机2.5×104r/min～8×104r/min，RCF5×105g或更高结构：离心管帽、冷冻装置和温控系统、真空系统、安全保护系统、制动系统、指示仪表等。按用途分：制备用超速离心机：分离纯化生物大分子、细胞器和病毒等分析用超速离心机：测定样品纯度（根据紫外吸收率或折光率等判断）、沉降系数、相对分子量第34页,共61页，2024年2月25日，星期天4、离心方法的选择对于常速和高速离心机，由于所分离的颗粒大小和密度相差较大，只要选择好离心速度和时间，就能达到分离效果。超速离心的离心方法：差速离心、密度梯度离心和等密度梯度离心第35页,共61页，2024年2月25日，星期天（1）差速离心采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法。主要用于分离大小和密度差异较大的颗粒。第36页,共61页，2024年2月25日，星期天（2）密度梯度离心样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比较接近的物质得以分离的一种区带分离方法。密度梯度系统：梯度介质有足够大的溶解度，不与分离组分反应，不会引起分离组分的凝集、变性或失活。常用介质：蔗糖、甘油等。样品铺在密度梯度溶液表面，离心后形成若干条界面清楚的不连续区带。第37页,共61页，2024年2月25日，星期天梯度混合器第38页,共61页，2024年2月25日，星期天（3）等密度离心当欲分离的不同颗粒的密度范围在离心介质的密度梯度范围内时，不同浮力密度的物质颗粒在离心力作用下一直移动到与各自浮力密度相等的位置（等密度点），形成区带。等密度离心常用的介质：铯盐，如CsCl，Cs2SO4，CsBr第39页,共61页，2024年2月25日，星期天5、离心条件的确定离心力（转速）离心时间温度pH值第40页,共61页，2024年2月25日，星期天6、离心机械管式离心机分为液－液分离的连续式管式离心机和液固分离的间歇式管式离心机。结构简单转速很高有利于蛋白质的分离间歇操作第41页,共61页，2024年2月25日，星期天碟片式离心机是一种应用最广泛的离心机有一个密封的转鼓，内装十至上百个锥顶角为60~100゜锥形碟片。固体的沉降距离极短，分离效果较好。碟片间的距离一般为0.5~2.5mm,与被分离物料的性质有关。第42页,共61页，2024年2月25日，星期天分类人工排渣的碟片离心机喷嘴排渣的碟片离心机活门（活塞）排渣的碟片离心机活门排渣的喷嘴碟片式离心机（这是近年来开发的机型，它和相同直径的活塞机相似，其速度可增加23%~30%,故可使分离因素达15000左右，该机型可用于酶制剂，疫苗和胰岛素生产中分离物的澄清，醇的生产中细菌的采集以及r-DNA中采集和澄清。第43页,共61页，2024年2月25日，星期天三、过滤（Filtration)过滤操作是借助于过滤介质，在一定的压力差ΔP作用下，将悬浮液中的固体粒子截留，而与液体分离的技术。衡量过滤特性的主要指标是滤饼的重量比阻rB，它表示单位滤饼厚度的阻力系数，与滤饼的结构特性有关。对于不可压缩性滤饼，比阻值为常数，但对于可压缩性滤饼，比阻rB，是操作压力差的函数第44页,共61页，2024年2月25日，星期天影响过滤的因素菌种：真菌，放线菌，细菌培养基：黄豆，花生，淀粉，后期加油，培养基未用完发酵时间：菌丝自溶前放罐黏度（发酵液）第45页,共61页，2024年2月25日，星期天过滤的难易程度根据滤饼的重量比阻值，可衡量各种不同发酵液过滤的难易程度。一般，真菌的菌丝比较粗大，如青霉素的重量比阻为（0.15~0.20）×l012m／kg左右，发酵液容易过滤，常不需特殊处理。放线菌发酵液菌丝细而分枝，交织成网络状，如链霉素重量比阻为2000×1012m/kg左右，过滤较困难，一般需经预处理。第46页,共61页，2024年2月25日，星期天改善过滤方法第47页,共61页，2024年2月25日，星期天分类：（1）澄清过滤：将硅藻土、砂芯、颗粒活性炭、玻璃珠、塑料颗粒等过滤介质填充于过滤器内构成过滤层（也有烧洁的陶瓷、金属制成的成型颗粒滤层），当悬浮液通过时，固体颗粒被阻拦马吸附在滤层的颗粒上，使滤液得以澄清。特点：过滤介质起主要的过滤作用，适合于固体含量少于0.1g/100ml，颗粒直径在5—100um的悬浮液的分离。（2）滤饼过滤（滤渣过滤）：以滤布（天然或合成纤维织布、金属织布，及毡、石棉板、玻动纤维纸、合成纤维等天纺布）为过滤介质，当悬浮液通过滤布时，固体颗粒被滤布所阻拦逐渐形成滤饼（滤渣），当滤饼至一定厚度时即起过滤作用。特点：滤饼起主要的过滤作用，适合于固体容量大于0.1g/100ml（悬浮液的过滤分离）。下面介绍板框过滤和真空转鼓过滤和错流过滤。第48页,共61页，2024年2月25日，星期天板框过滤在发酵工业中广泛应用框的形式第49页,共61页，2024年2月25日，星期天在板与框的角上均开有孔，组合后即构成供滤浆和洗涤水流通的孔道。滤框上角的孔有小通道与框内的空间相通，为滤浆的进入口。滤框的两侧覆以滤布，围成容纳滤浆和滤饼的空间。滤板有洗涤板和非洗涤板两种，它们的结构与作用有所不同，图中图(a)表示的为非洗涤板，图(b)为洗板，非洗涤板右下角的孔与板面两侧相通，可排出洗涤液；洗板左上角的孔与板面的两侧相通，洗涤液可以由此通入。板和框的结构第50页,共61页，2024年2月25日，星期天板框过滤机第51页,共61页，2024年2月25日，星期天真空转鼓过滤大规模工业生产，常用的过滤设备之一第52页,共61页，2024年2月25日，星期天（1）工作过程①过滤转鼓下部浸没于待过滤的悬浮区中（过滤区），滤液在大气压的作用下透过滤布进入转鼓内腔（有一定真空度），滤渣留在转鼓表面的过滤介质上形成滤饼。②当转鼓继续转动，生成的滤饼被洗涤吸干（洗涤吸干区）和卸除（卸渣区）③为了除去堵塞在滤布孔隙中的细微颗粒，压缩空气阀进入再生区，吹落这些微粒，使滤布再生。转周一个过滤循环。第53页,共61页，2024年2月25日，星期天（2）特点①自动化程度高、操作连续、处理量大；②适合于固体含量较大（＞10%）的悬浮液的分离；③一般不适合于菌体较小和粘度较大的细菌发酵液的过滤。（可以离心）④所得固相的干度较差。