水处理微生物学实验指导书样本

水解决微生物学实验指引书班级姓名学号市政与环境工程学院年月目录实验一显微镜、测微尺使用及生物相观测实验二革兰氏染色技术实验三培养基配制和灭菌实验四水中细菌总数测定实验一显微镜、测微尺使用及生物相观测一、实验目与规定理解普通光学显微镜构造与功能，学习与掌握显微镜观测微生物办法。观测细菌、放线菌和蓝细菌个体形态，学会绘制微生物形态构造图。二、显微镜基本构造和功能普通光学显微镜是一种精密光学仪器。以往最简朴显微镜仅由几块透镜构成，而当前使用显微镜由一套透镜构成。普通光学显微镜普通能将物体放大1500—倍。（一）显微镜构造普通光学显微镜构造可分为两大某些：一为机械装置，一为光学系统，这两某些较好配合，才干发挥显微镜作用。1、显微镜机械装置显微镜机械装置涉及镜座、镜筒、物镜转换器、载物台、推动器、粗动螺旋、微动螺旋等部件。（1）镜座

镜座是显微镜基本支架，它由底座和镜臂两某些构成。在它上面连接有载物台和镜筒，它是用来安装光学放大系统部件基本。

（2）镜筒

镜筒上接接目镜，下接转换器，形成接目镜与接物镜（装在转换器下）间暗室。从物镜后缘到镜筒尾端距离称为机械筒长。由于物镜放大率是对一定镜筒长度而言。镜筒长度变化，不但放大倍率随之变化，并且成像质量也受到影响。因而，使用显微镜时，不能任意变化镜筒长度。国际上将显微镜原则筒长定为160mm，此数字标在物镜外壳上。

（3）物镜转换器

物镜转换器上可安装3—4个接物镜，普通是三个接物镜（低倍、高倍、油镜）。Nikon显微镜装有四个物镜。转动转换器，可以按需要将其中任何一种接物镜和镜筒接通，与镜筒上面接目镜构成一种放大系统。

（4）载物台

载物台中央有一孔，为光线通路。在台上装有弹簧标本夹和推动器，其作用为固定或移动标本位置，使得镜检对象正好位于视野中心。

（5）推动器

是移动标本机械装置，它是由一横一纵两个推动齿轴金属架构成，好显微镜在纵横架杆上刻有刻度标尺，构成很精密平面座标系。如果咱们须重复观测已检查标本某一某些，在第一次检查时，可记下纵横标尺数值，后来按数值移动推动器，就可以找到本来标本位置。

（6）粗动螺旋

粗动螺旋是移动镜筒调节接物镜和标本间距离机件，老式显微镜粗螺旋向前扭，镜头下降接近标本。新近出产显微镜（如Nikon显微镜）镜检时，右手向前扭载物台上升，让标本接近物镜，反之则下降，标本脱离物镜。

（7）微动螺旋

用粗动螺旋只可以粗放调节焦距，要得到最清晰物象，需要用微动螺旋做进一步调节。微动螺旋每转一圈镜筒移动0.1毫米（100微米）。新近出产较高档次显微镜粗动螺旋和微动螺旋是共轴。2、显微镜光学系统显微镜光学系统由反光镜，聚光器，接物镜，接目镜等构成，光学系统使物体放大，形成物体放大像。

（1）反光镜

较早普通光学显微镜是用自然光检视物体，在镜座上装有反光镜。反光镜是由一平面和另一凹面镜子构成，可以将投射在它上面光线反射到聚光器透镜中央，照明标本。不用聚光器时用凹面镜，凹面镜能起会聚光线作用。用聚光器时，普通都用平面镜。新近出产较高档次显微镜镜座上装有光源，并有电流调节螺旋，可通过调节电流大小调节光照强度。

（2）聚光器

聚光器在载物台下面，它是由聚光透镜、虹彩光圈和升降螺旋构成。聚光器可分为明视场聚光器和暗视场聚光器。普通光学显微镜配备都是明视场聚光器，明视场聚光器有阿贝聚光器、齐明聚光器和摇出聚光器。阿贝聚光器在物镜数值孔径高于0.6时会显示出众差和球差。齐明聚光器对色差、球差和慧差校正限度很高，是明视场镜检中质量最佳聚光器，但它不适于4倍如下物镜。摇出聚光器能将聚光器上透镜从光路中摇出满足低倍物镜（4×）大视场照明需要。聚光器安装在载物台下，其作用是将光源经反光镜反射来光线聚焦于样品上，以得到最强照明，使物象获得明亮清晰效果。聚光器高低可以调节，使焦点落在被检物体上，以得到最大亮度。普通聚光器焦点在其上方1.25mm处，而其上升限度为载物台平面下方0.1mm。因而，规定使用载玻片厚度应在0.8—1.2mm之间，否则被检样品不在焦点上，影响镜检效果。聚光器前透镜组前面还装有虹彩光圈，它可以开大和缩小，影响着成像辨别力和反差，若将虹彩光圈开放过大，超过物镜数值孔径时，便产生光斑；若收缩虹彩光圈过小，辨别力下降，反差增大。因而，在观测时，通过虹彩光圈调节再把视场光阑（带有视场光阑显微镜）启动到视场周缘外切处，使不在视场内物体得不到任何光线照明，以避免散射光干扰。

（3）物镜

安装在镜筒前端转换器上接物透镜运用光线使被检物体第一次造像，物镜成像质量，对辨别力有着决定性影响。物镜性能取决于物镜数值孔径（numericalapeature简写为NA），每个物镜数值孔径都标在物镜外壳上，数值孔径越大，物镜性能越好。物镜种类诸多，可从不同角度来分类：依照物镜前透镜与被检物体之间介质不同，可分为：①干燥系物镜

以空气为介质，如惯用40×如下物镜，数值孔径均不大于1。②油浸系物镜

常以香柏油为介质，此物镜又叫油镜头，其放大率为90×—100×，数值孔值不不大于1。依照物镜放大率高低，可分为：①低倍物镜

指1×—6×，NA值为0.04—0.15；②中倍物镜

指6×—25×，NA值为0.15—0.40；③高倍物镜

指25×—63×，NA值为0.35—0.95；④油浸物镜

指90×—100×，NA值为1.25—1.40。依照物镜像差校正限度来分类可分为：①消色差物镜

是最惯用物镜，外壳上标有“Ach”字样，该物镜可以除红光和青光形成色差。镜检时普通与惠更斯目镜配合使用。②复消色差物镜

物镜外壳上标有“Apo”字样，除能校正红、蓝、绿三色光色差外，还能校正黄色光导致相差，普通与补偿目镜配合使用。③特种物镜

在上述物镜基本上，为达到某些特定观测效果而制造物镜。如：带校正环物镜，带视场光阑物镜，相差物镜，荧光物镜，无应变物镜，无罩物镜，长工作距离物镜等。当前在研究中惯用物镜尚有：半复消色差物镜（FL），平场物镜(Plan)，平场复消色差物镜（PlanApo）,超平场物镜（Splan，超平场复消色差物镜（SplanApo）等。

（4）目镜

目镜作用是把物镜放大了实像再放大一次，并把物像映入观测者眼中。目镜构造较物镜简朴，普通光学显微镜目镜普通由两块透镜构成，上端一块透镜称“接目镜”，下端透镜称“场镜”。上下透镜之间或在两个透镜下方，装有由金属制环状光阑或叫“视场光阑”，物镜放大后中间像就落在视场光阑平面处，因此其上可安顿目镜测微尺。普通光学显微镜惯用目镜为惠更斯目镜（Huygenseyepiece），如要进行研究用时，普通选用性能更好目镜，如补偿目镜（K）、平场目镜（P）、广视场目镜（WF）。照相时选用照相目镜（NFK）。（二）光学显微镜成像原理显微镜放大是通过透镜来完毕，单透镜成像具备像差，影响像质。由单透镜组合而成透镜组相称于一种凸透镜，放大作用更好。（三）显微镜性能显微镜辨别能力高低决定于光学系统各种条件。被观测物体必要放大率高，并且清晰，物体放大后，能否呈现清晰细微构造，一方面取决于物镜性能，另一方面为目镜和聚光镜性能。

1、数值孔径也叫做镜口率（或开口率），简写为N.A，在物镜和聚光器上都标有它们数值孔径，数值孔径是物镜和聚光器重要参数，也是判断它们性能最重要指标。数值孔径和显微镜各种性能有密切关系，它与显微镜辨别力成正比，与焦深成反比，与镜象亮度平方根成正比。数值孔径可用下式表达：N.A=n.sinα2式中：n—物镜与标本之间介质析射率α—物镜镜口角所谓镜口角是指从物镜光轴上物点发出光线与物镜前透镜有效直径边沿所张角度。镜口角α总是不大于180°。由于空气折射率为1，因此干燥物镜数值孔径总是不大于1，普通为0.05—0.95；油浸物镜如用香柏油（折射率为1.515）浸没，则数值孔径最大可接近1.5。虽然理论上数值孔径极限等于所用浸没介质折射率，但事实上从透镜制造技术看，是不也许达到这一极限。普通在实用范畴内，高档油浸物镜最大数值孔径是1.4。几种物质介质折射率如下：空气为1.0，水为1.33，玻璃为1.5，甘油为1.47，香柏油为1.52。

2、辨别力D可用下式表达：D=λ/2N.A.可见光波长为0.4—0.7微米，平均波长为0.55微米。若用数值孔为0.65物镜，则D=0.55微米/2×0.65=0.42微米。这表达被检物体在0.42微米以上时可被观测到，若不大于0.42微米就不能视见。如果使用数值孔径为1.25物镜，则D=2.20微米。凡被检物体长度不不大于这个数值，均能视见。由此可见，D值愈小，辨别力愈高，物象愈清晰。依照上式，可通过：（1）减低波长；（2）增大折射率；（3）加大镜口角来提高辨别力。紫外线作光源显微镜和电子显微镜就是运用短光波来提高辨别力以检视较小物体。物镜辨别力高低与造象与否清晰有密切关系。目镜没有这种性能。目镜只放大物镜所造象。

3、放大率：显微镜放大物体，一方面通过物镜第一次放大造象，目镜在明视距离导致第二次放大象。放大率就是最后象和原物体两者体积大小之比例。因而，显微镜放大率（V）等于物镜放大率（V1）和目镜放大率（V2）乘积，即：V=V1×V2比较精准计算办法，可从下列公式求得M=△×DF1F2F1=接物镜焦距，F2=接目镜焦距

△=光学筒长，D=明视距离（=250毫米）△=接物镜放大倍数D=接目镜放大倍数M=显微镜放大倍数F1F2设△=160毫米

F1=4毫米

D=250毫米

F2=150毫米则M=△×D=160×250=40×16.7=668倍F1F2415

4、焦深：在显微镜下观测一种标本时，焦点对在某一象面时，物象最清晰，这象面为目面。在视野内除目面外，还能在目面上面和下面看见模糊物象，这两个面之间距离称为焦深。物镜焦深和数值孔径及放大率成反比：即数值孔径和放大率愈大，焦深愈小。因而调节油镜比调节低倍镜要更加仔细，否则容易使物象滑过而找不到。

三、实验器材显微镜、擦镜纸等标本片香柏油、二甲苯四、显微镜使用操作及注意事项显微镜构造精密，使用时必要细心，要按下述操作环节进行。（一）观测前准备1、显微镜从显微镜柜或镜箱内拿出时，要用右手紧握镜臂，左手托住镜座，平稳地将显微镜搬运到实验桌上。2、将显微镜放在自己身体左前方，离桌子边沿约10cm左右，右侧可放记录本或绘图纸。3、调节光照不带光源显微镜，可运用灯光或自然光通过反光镜来调节光照，但不能用直射阳光，直射阳光会影响物像清晰并刺激眼睛。将10×物镜转入光孔，将聚光器上虹彩光圈打开到最大位置，用左眼观测目镜中视野亮度，转动反光镜，使视野光照达到最明亮最均匀为止。光线较强时，用平面反光镜，光线较弱时，用凹面反光镜。自带光源显微镜，可通过调节电流旋钮来调节光照强弱。4、调节光轴中心显微镜在观测时，其光学系统中光源、聚光器、物镜和目镜光轴及光阑中心必要跟显微镜光轴同在始终线上。带视场光阑显微镜，先将光阑缩小，用10×物镜观测，在视场内可见到视场光阑圆球多边形轮廓像，如此像不在视场中央，可运用聚光器外侧两个调节旋钮将其调到中央，然后缓慢地将视场光阑打开，能看到光束向视场周缘均匀展开直至视场光阑轮廓像完全与视场边沿内接，阐明光线已经合轴。 切忌用单手拎提；且无论使用单筒显微镜或双筒显微镜均应双眼同步睁开观测，以减少眼睛疲劳，也便于边观测边绘图或记录。（二）低倍镜观测

镜检任何标本都要养成必要先用低倍镜观测习惯。由于低倍镜视野较大，易于发现目的和拟定检查位置。 将标本片放置在载物台上，用标本夹夹住，移动推动器，使被观测标本处在物镜正下方，转动粗调节旋钮，使物镜调至接近标本处，用目镜观测并同步用粗调节旋钮慢慢升起镜筒（或下降载物台），直至物像浮现，再用细调节旋钮使物像清晰为止。用推动器移动标本片，找到适当目像并将它移到视野中央进行观测。 在任何时候使用粗调节器聚焦物像时，必须养成先从侧面注视小心调节物镜接近标本，然后用目镜观测，慢慢调节物镜离开标本进行准焦习惯，以免因一时误操作而损坏镜头及玻片。（三）高倍镜观测

在低倍物镜观测基本上转换高倍物镜。较好显微镜，低倍、高倍镜头是同焦，在正常状况下，高倍物镜转换不应遇到载玻片或其上盖玻片。若使用不同型号物镜，在转换物镜时要从侧面观测，避免镜头与玻片相撞。然后从目镜观测，调节光照，使亮度适中，缓慢调节粗调节旋钮，使载物台上升（或镜筒下降），直至物像浮现，再用细调节旋钮调至物像清晰为止，找到需观测部位，并移至视野中央进行观测。 在普通状况下，当物像在一种物镜中已清晰聚焦后，转动物镜转换器将其她物镜转到工作位置进行观测时，物像将保持基本准焦状态，这种现象称为物镜同焦。运用这种同焦现象，可以保证在使用高倍镜或油镜等放大倍数高、工作距离短物镜时仅用细调节器即可对物像清晰聚焦，从而避免由于使用粗调节器时也许误操作而损坏镜头或载玻片。（四）油镜观测

油浸物镜工作距离（指物镜前透镜表面到被检物体之间距离）很短，普通在0.2mm以内，再加上普通光学显微镜油浸物镜没有“弹簧装置”，因而使用油浸物镜时要特别细心，避免由于“调焦”不慎而压碎标本片并使物镜受损。使用油镜按下列环节操作：1、先用粗调节旋钮将镜筒提高（或将载物台下降）约2cm，并将高倍镜转出。2、在玻片标本镜检部位滴上一滴香柏油。3、从侧面注视，用粗调节旋钮将载物台缓缓地上升，（或镜筒下降），使油浸物镜浸入香柏油中，使镜头几乎与标本接触。4、从接目镜内观测，放大视场光阑及聚光镜上虹彩光圈（带视场光阑油镜开大视场光阑），上调聚光器，使光线充分照明。用粗调节旋钮将载物台徐徐下降（或镜筒上升），当浮现物像一闪后改用细调节旋钮调至最清晰为止。如油镜已离开油面而仍未见到物象，必要再从侧面观测，重复上述操作。 有时按上述操作还找不到目物，则也许是由于油镜头下降尚未到位，或因油镜上升太快。以至眼睛捕获不到一闪而过物像。遇此状况，应重新操作。此外应特别注意不要因在下降镜头时用力过猛，或调焦时误将粗调节器向反方向转动而损坏镜头及载玻片。5、观测完毕，下降载物台，将油镜头转出，先用擦镜纸擦去镜头上油，再用擦镜纸蘸少量乙醚酒精混合液（乙醚2份，纯酒精3份）或二甲苯，擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦拭2—3下即可，（注意向一种方向擦拭）。6、将各某些还原，转动物镜转换器，使物镜头不与载物台通光孔相对，而是成八字形位置，再将镜筒下降至最低，降下聚光器，反光镜与聚光器垂直，用一种干净手帕将接目镜罩好，以免目镜头沾污灰尘。最后用柔软纱布清洁载物台等机械某些，然后将显微镜放回柜内或镜箱中。7、有菌玻片置消毒缸中，清洗、晾干后备用。五、微生物大小测定微生物细胞大小，是微生物重要形态特性之一，也是分类鉴定根据之一。由于菌体很小、只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小工具备目镜测微尺和镜台测微尺。目镜测微尺（图20-1）是一块圆形玻片，在玻片中央把5mm长度刻成50等分，或把10mm长度刻成100等分。测量时，将其放在接目镜中隔板上(此处正好与物镜放大中间像重叠)来测量经显微镜放大后细胞物象。由于不同目镜、物镜组合放大倍数不相似，目镜测微尺每格实际表达长度也不同样，因而目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上镜台测微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表相对长度。镜台测微尺（图20-2）是中央某些刻有精准等分线载玻片，普通将lmm等分为100格，每格长l0μm（即0.0lmm），是专门用来校正目镜测微尺。校正时，将镜台测微尺放在载物台上。

图20-1目镜测微尺

由于镜台测微尺与细胞标本是处在同一位置，都要通过物镜和目镜两次放大成象进入视野，即镜台测微尺随着显微镜总放大倍数放大而放大，因而从镜台测微尺上得到读数就是细胞真实大小，因此用镜台测微尺已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表长度，然后移去镜台测微尺，换上待测标本片，用校正好目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。六、实验报告1、成果分别绘出你在低倍镜、高倍镜和油镜下观测到标本片形态，涉及在三种状况下视野中变化，同步注明物镜放大倍数和总放大率。2、思考题(1)用油镜观测时应注意哪些问题?在载玻片和镜头之间加滴什么油?起什么作用?(2)试列表比较低倍镜、高倍镜及油镜各方面差别。为什么在使用高倍镜及油镜时应特别注意避免粗调节器误操作?(3)什么是物镜同焦现象?它在显微镜观测中有什么意义?(4)影响显微镜辨别率因素有哪些？(5)依照你实验体会，谈谈应如何依照所观测微生物大小，选取不同物镜进行有效观测。实验二革兰氏染色技术一、实验目学习微生物染色基本技术，掌握微生物革兰氏染色办法。二、实验原理革兰氏染色是细菌学中极为重要鉴别染色法。其原理重要是由于细菌细胞壁构造差别，导致对结晶紫—碘复合物渗入性不同，产生革兰氏反映呈现出阴性或阳性。由此通过革兰氏染色可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌（G＋）和革兰氏阴性菌（G－）两个类。若菌体被结晶紫初染时，染上紫色不被酒精脱色者为G＋菌；若被酒精脱色，而复染上红色者为G－菌。通过该染色法也可以观测细菌个体形状、排列、芽孢有无及其形状、大小和着色位置等。三、实验内容1.染色剂=1\*GB2⑴赫克尔氏结晶紫液甲液：结晶紫2g乙液：草酸铵0.8g乙醇（95%）20ml蒸馏水80ml将甲、乙两液混合，静置48小时后使用。该染液较稳定，在不透气棕色瓶中可储存数月。=2\*GB2⑵卢哥氏碘液碘片：1.0g碘化钾：2.0g蒸馏水：300ml先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，再放入碘片，待碘片全溶后，加水至300ml。此液稳定，在不透气棕色瓶中可存数月。=3\*GB2⑶脱色液：95%乙醇。=4\*GB2⑷复染液：即0.5%番红水溶液。番红(safranine，又称沙黄O)2.5g，95%乙醇100mL取2.5%番红（又称沙黄）酒精溶液20ml，蒸馏水80ml。2.操作环节=1\*GB2⑴涂片。取适当细菌涂片，涂片时要使菌体薄而均匀，否则菌体群集会呈现假阳性。=2\*GB2⑵干燥和固定。自然风干或微热促其干燥，然后在火焰上通过1～2次，以固定涂片。=3\*GB2⑶初染。滴加结晶紫液，覆盖约1分钟。用水冲净结晶紫液。=4\*GB2⑷媒染。滴加碘液冲去残水，并覆盖约1分钟。用水冲去碘液，将载玻片上水甩净或用滤纸吸干。=5\*GB2⑸脱色。将载玻片倾斜，并衬以白背景，流滴95%乙醇约20～30秒，及时用水冲净乙醇。=6\*GB2⑹复染。用番红液1～2分钟，使已脱色细胞重新着色，便于鉴别观测。水洗、待干，镜检。=7\*GB2⑺镜检。用油镜观测单独分散菌体，菌体呈蓝紫者为G＋，红色者为G-。四、结论实验与否成功，成果如何？不成功因素是什么？五、问题1.革兰氏染色基本原理是什么？2.大肠杆菌和枯草芽孢杆菌经革兰氏染色后各有什么成果？3.结晶紫染色时间不够或染色时间过久会对成果有何影响？4.革兰氏染色在微生物学中有何实践意义？实验三培养基配制和灭菌一、实验目与规定：熟悉玻璃器皿洗涤包装和灭菌前准备工作。学习微生物培养基和无菌水制备，理解培养基配方中各成分作用、制备流程及各环节操作技术与应用。学习并掌握培养基高压蒸气灭菌原理、操作核心技术和灭菌技术。二、实验原理培养基制备原理培养基是按照微生物生长发育需要，用不同组分营养物质调制而成营养基质。人工制备培养基目，在于给微生物创造一种良好营养条件。把一定培养基放入一定器皿中，就提供了人工繁殖微生物环境和场合。自然界中，微生物种类繁多，由于微生物具备不同营养类型，对营养物质规定也各不相似，加之实验和研究上目不同，因此培养基在构成原料上也各有差别。但是，不同种类和不同构成培养基中，均应具有满足微生物生长发育水分、碳源、氮源、无机盐和生长素以及某些特需微量元素等。此外，培养基还应具备适当酸碱度(pH值)和一定缓冲能力及一定氧化还原电位和适当渗入压。依照制备培养基对所选用营养物质来源，可将培养基分为天然培养基、半合成培养基和合成培养基三类。按照培养基形态可将培养基分为液体培养基和固体培养基。依照培养基使用目，可将培养基分为选取培养基、加富培养基及鉴别培养基等。培养基类型和种类是各种各样，必要依照不同微生物和不同目进行选取配制，本实验分别配制惯用培养细菌、放线菌和真菌牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号合成培养基和马铃薯蔗糖培养基等固体培养基。固体培养基是在液体培养基中添加凝固剂制成，惯用凝固剂有琼脂、明胶和硅酸钠，其中以琼脂最为惯用，其重要成分为多糖类物质，性质较稳定，普通微生物不能分解，故用凝固剂而不致引起化学成分变化。琼脂在95℃热水中才开始融化，融化后琼脂冷却到45℃才重新凝固。因而用琼脂制成固体培养基在普通微生物培养温度范畴内(25℃-37℃)不会融化而保持固体状态。高压蒸气灭菌原理高压蒸汽灭菌是将待灭菌物品放在一种密闭加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增长了灭菌器内压力，从而使沸点增高，得到高于100℃温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌目。在同一温度下，湿热杀菌效力比干热大，其因素有三：一是湿热中细菌菌体吸取水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增长，所需凝固温度减少(表Ⅴ-2)，二是湿热穿透力比干热大(表Ⅴ-3)；三是湿热蒸汽有潜热存在，每1克水在100℃时，由气态变为液态时可放出2.26kJ(千焦)热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体温度，从而增长灭菌效力表Ⅴ-2蛋白质含水量与凝固所需温度关系卵自蛋白含水量(%)30分钟内凝固所需温度(℃)502518605674-8080-90145160-170表Ⅴ-3干热与湿热穿透力及灭菌效果比较温度(℃)时间(小时)透过布层温度(℃)灭菌20层40层100层干热130-1404867270.5不完全湿热105.3310l10l10l完全在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气排除与否完全极为重要，由于空气膨胀压不不大于水蒸汽膨胀压，因此，当水蒸汽中具有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽温度低于饱和蒸汽温度。灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温度关系见表Ⅴ-4。普通培养基用1.05kg/cm2，121.3℃15-30分钟可达到彻底灭菌目。灭菌温度及维持时间随灭菌物品性质和容量等详细状况而有所变化。例如含糖培养基用0.56kg/cm2(8磅/英寸2)，112.6℃灭菌15分钟，但为了保证效果，可将其她成分先行121.3℃，20分钟灭菌，然后以无菌操作手续加入灭菌糖溶液。又如盛于试管内培养基以1.05kg/cm2，121.3℃灭菌20分钟即可，而盛于大瓶内培养基最佳以1.05kg/cm2灭菌30分钟。表Ⅴ-4灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温度关系压力数所有空气排出时温度(℃)2/3空气排出时温度(℃)l/2空气排出时温度(℃)1/3空气排出时温度(℃)空气全不排出时温度(℃)公斤(公斤/厘米2)(kg/cm2)磅/英寸2(1b/in2)0.350.701.051.401.752.1051015202530108.8115.6121.3126.2130.0134.610010911512112613094105112118124128901001091151211267290100109115121 蒸汽压力所用单位为kg/cm2(公斤/厘米2)，它与1b/in2(磅/英寸2)和温度换算关系见表Ⅴ-5。表Ⅴ-5蒸汽压力与蒸汽温度换算关系蒸汽压力大气压压力表读数蒸汽温度kg/cm21b/in21.001.251.501.752.002.503.000.000.250.500.751.001.502.000.003.757.5011.2515.0022.5030.00100.0107.0112.0115.0121.0128.0134.5三、实验器材1、

药物琼脂，10％HCL,10%NaOH，牛肉膏蛋白胨培养基配方药物；2、

材料具刻度1000毫升塘瓷盅或小铝锅，电子称，10×200mm试管，量筒，小烧杯，玻璃棒，骨匙，pH试纸，分装漏斗，试管盒，纱布，棉花，报纸，麻绳，标签，培养皿。3、设备高压蒸汽灭菌锅、烘箱、冰箱、电炉等四、实验环节称取药物放在大烧杯中，加入蒸馏水用玻璃棒搅拌并加热溶化，等药物溶解后用pH试纸调节pH至7.4-7.6，如有沉淀应过滤后分装，每支试管约加入9ml。每组分装30支，加上棉塞，包上牛皮纸，准备灭菌。 装入试管中量不适当超过试管高度1/5，装入三角烧瓶中量以烧瓶总体积一半为限。在分装过程中，应注意勿使培养基沾污管口或瓶口、以免弄湿棉塞，导致污染。2、无菌水准备在试管或瓶内先盛以适量蒸馏水〔或生理盐水O．85％NaCl)，盖好棉塞，包上牛皮纸使其灭菌后，其水量恰为9ml。每组准备10支与牛肉膏蛋白胨培养基可放在同一试管架上，以一大张牛皮纸包扎写上姓名。准备灭菌。3、高压灭菌手提式高压蒸汽灭菌锅使用操作环节：（1）一方面将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量水，使水面与三角搁架相平为宜。（2）放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口纸而透入棉塞。（3）加盖，并将盖上排气软管插入内层灭菌桶排气槽内。再以两两对称方式同步旋紧相对两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。（4）用电炉或煤气加热，并同步打开排气阀，使水沸腾以排除涡内冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内温度随蒸汽压力增长而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用1.05kg/cm2，121.3℃，20分钟灭菌。（5）灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表压力降至0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。如果压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，导致棉塞沾染培养基而发生污染。（6）将取出灭菌培养基放入37℃温箱培养24小时，经检查若无杂菌生长，即可待用。五、思考题棉塞作用？实验四水中细菌总数测定一、实验目1.学习水样采用办法和水样细菌总数测定办法。2.理解水源水平板菌落计数原理。二、实验原理本实验应用平板计数技术测定水中细菌总数。由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其她生长条件规定差别很大，不也许找到一种培养基在一种条件下，使水中所有细菌均能生长繁殖，因而，以一定培养基平板上生长出来菌落，计算出来水中细菌总数仅是一种近似值。当前普通是采用普通牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。三、试剂与器材1.试剂牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，灭菌水牛肉膏3g蛋白胨10gNaCl5g琼脂15-20g蒸馏水1000ml（配备1/4量）2.器材灭菌三角瓶，灭菌带玻璃塞瓶，灭菌培养皿，灭菌吸管，灭菌试管等。四、实验内容细菌总数是指1ml或1g检样中所含细菌菌落总数，所用办法是稀释平板计数法，由于计算是平板上形成菌落数，它反映是检样中活菌数量。