课题微生物的实验室培养

课题微生物的实验室培养放线菌第2页,共45页，2024年2月25日，星期天真菌青霉菌第3页,共45页，2024年2月25日，星期天黑曲霉酵母菌第4页,共45页，2024年2月25日，星期天想一想这些肉眼看不到的微生物是怎样获得呢？第5页,共45页，2024年2月25日，星期天课题1微生物的实验室培养专题2微生物的培养与应用第6页,共45页，2024年2月25日，星期天一、培养基1、培养基的定义：培养基是人们按照微生物对营养物质的不同需求，配置出供其生长繁殖的营养物质。第7页,共45页，2024年2月25日，星期天2、培养基分类：（1）液体培养基：配置成的液体状态的基质。第8页,共45页，2024年2月25日，星期天（2）固体培养基：在液体培养基中加入凝固剂琼脂配制成的固体状态的基质。2、培养基的分类：第9页,共45页，2024年2月25日，星期天你知道固体培养基的来历吗？为了能直接观察培养物的形态及生长情况，科学家希望能将微生物培养在固体表面上，就像微生物生长在橘子皮或土豆上一样。最初，德国医生罗伯特·科赫此试着用明胶作培养基的凝固剂。但是，人们很快发现，明胶在20℃以上就变软了，很难进行分离微生物的划线操作。而大多数细菌的培养温度都不低于25℃。科赫的同事WalterHesse发现琼脂比明胶更适合做培养基的凝固剂。这个改进的方法很快就被大家采纳。第10页,共45页，2024年2月25日，星期天菌落：单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。菌落是鉴定菌种的重要依据。第11页,共45页，2024年2月25日，星期天培养基一般都含有碳源、氮源、无机盐(包括微量元素)、水。注意碳源—有机碳源（葡萄糖、果糖、蔗糖等）、无机碳源有机氮源—花生饼粉、黄豆饼粉、酵母粉、蛋白胨等无机氮源—氨水、铵盐和硝酸盐。归纳第12页,共45页，2024年2月25日，星期天不管哪种培养基，一般都含有____、____、和____、______等营养物质，另外还需要满足微生物生长对____、___________以及对__________,例如:培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加________，培养霉菌时需将培养基的pH调至______，培养细菌时需将pH调至__________，培养厌氧微生物时则需要提供______的条件。水碳源氮源无机盐pH特殊营养物质氧气的要求维生素酸性中性或微碱性无氧第13页,共45页，2024年2月25日，星期天二、无菌技术1、什么是无菌技术无菌技术泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。第14页,共45页，2024年2月25日，星期天注意事项对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。第15页,共45页，2024年2月25日，星期天无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。第16页,共45页，2024年2月25日，星期天2、消毒与灭菌

灭菌是指使用强烈的物理或化学因素杀死体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。

消毒是指使用较为温和的物理或化学方法杀死或除去部分微生物，对于芽孢或孢子则不起作用。第17页,共45页，2024年2月25日，星期天芽孢有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌孢子细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖或休眠作用的生殖细胞。能直接发育成新个体。第18页,共45页，2024年2月25日，星期天第19页,共45页，2024年2月25日，星期天比较项理化因素的作用强度消灭微生物的数量芽孢和孢子能否被消灭消毒灭菌较为温和强烈部分生活状态的微生物不能全部微生物能第20页,共45页，2024年2月25日，星期天1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3、化学药剂消毒法:用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源4、紫外线消毒……(1)消毒的方法：3.常用的消毒与灭菌的方法第21页,共45页，2024年2月25日，星期天(1)消毒的方法：3.常用的消毒与灭菌的方法（1）日常生活经常用到的是

煮沸消毒法；（2）对一些不耐高温的液体，则使用

巴氏

消毒法（3）对接种室、接种箱或超净工作台首先喷洒石炭酸或煤酚皂等溶液以增强消毒效果，然后使用

紫外线进行物理消毒。（4）实验操作者的双手使用酒精进行消毒；（5）饮水水源用氯气进行消毒。第22页,共45页，2024年2月25日，星期天1、灼烧灭菌2、干热灭菌：160-170℃下加热1-2h。3、高压蒸气灭菌：100kPa、121℃下维持15-30min.(2)灭菌的方法：第23页,共45页，2024年2月25日，星期天（1）接种环、接种针、试管口等使用

灼烧

灭菌法；（2）玻璃器皿、金属用具等使用干热灭菌法，所用器械是

干热灭菌箱；（3）培养基、无菌水等使用高压蒸汽

灭菌法，所用器械是

高压蒸汽灭菌锅。第24页,共45页，2024年2月25日，星期天思考题请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管（3）实验操作者的双手答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。第25页,共45页，2024年2月25日，星期天三、实验安排本实验采用牛肉膏蛋白胨固体培养基进行大肠杆菌的纯化培养，实验过程分为两个阶段：1、制备培养基2、纯化大肠杆菌大肠杆菌第26页,共45页，2024年2月25日，星期天1、制备培养基牛肉膏蛋白胨固体培养基配方牛肉膏5.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g琼脂20.0g将上述物质溶解后，用蒸馏水定容至1000mL（1）计算根据下列培养基配方比例，计算配置100mL培养基时，各成分的用量。第27页,共45页，2024年2月25日，星期天（2）称量注意

牛肉膏和蛋白胨都容易吸潮，称取时动作要迅速，称后要及时盖上瓶盖。蛋白胨牛肉膏用玻璃棒挑取牛肉膏第28页,共45页，2024年2月25日，星期天（3）溶化①加水加热熔化牛肉膏；②加入蛋白胨和氯化钠继续加热；③加入琼脂；④用蒸馏水定容到100mL。整个过程不断用玻棒搅拌，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。第29页,共45页，2024年2月25日，星期天（4）灭菌在压力为100kPa，温度为121℃条件下，灭菌15-30min。（5）倒平板第30页,共45页，2024年2月25日，星期天倒平板技术第31页,共45页，2024年2月25日，星期天答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。讨论1.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？第32页,共45页，2024年2月25日，星期天2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。第33页,共45页，2024年2月25日，星期天4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。第34页,共45页，2024年2月25日，星期天2、纯化大肠杆菌（1）平板划线法平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到有一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体。第35页,共45页，2024年2月25日，星期天微生物的接种技术平板划线法第36页,共45页，2024年2月25日，星期天培养基表面的单菌落第37页,共45页，2024年2月25日，星期天1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？议一议第38页,共45页，2024年2月25日，星期天答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。第39页,共45页，2024年2月25日，星期天2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。议一议第40页,共45页，2024年2月25日，星期天（2）稀释涂布法稀释涂布法是将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。第41页,共45页，2024年2月25日，星期天微生物的接种技术稀释涂布平板法第42页,共45页，2024年2月25日，星期天应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等.第43页,共45页，2024年2月25日，星期天四、结果分析与评价

培养12h与24h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同（一）培养基的制作是否合格如果未接种的培养基在恒温箱中保温1～2d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制