酶的高度纯化之正负电荷法

酶的高度纯化之正负电荷法酶的高度纯化之正负电荷法知识点1、利用正负电荷纯化的原理

2、按电荷正负差异法分离的方法

3、各个技术的原理及操作（重点）第2页,共29页，2024年2月25日，星期天酶的高度纯化之正负电荷法

原理

利用酶分子与杂蛋白所带正负电荷多少的不同，在一定条件下，如通电加电极、加有极性的薄膜等，又有同性相斥，异性相吸的原理，于是，酶分子与杂蛋白在介质中就会向不同的方向移动，从而达到分离的目的。第3页,共29页，2024年2月25日，星期天酶的高度纯化之正负电荷法电场膜分离电渗析离子交换膜电渗析电泳分离纸电泳薄层电泳薄膜电泳凝胶电泳自由电泳等电聚焦电泳层析分离：层析聚焦（按介质）第4页,共29页，2024年2月25日，星期天酶的高度纯化之正负电荷法电场膜分离原理

在电场作用下，小分子的带电物质或离子向着与其本身所带电荷相反的电极移动，透过半透膜，从而达到分离的目的。在半透膜两侧分别装上正、负极。第5页,共29页，2024年2月25日，星期天酶的高度纯化之正负电荷法电渗析离子交换膜电渗析电场膜分离。第6页,共29页，2024年2月25日，星期天酶的高度纯化之正负电荷法电解（Electrolysis）

是将电流通过电解质溶液或熔融态物质，（又称电解液），在阴极和阳极上引起氧化还原反应的过程，电化学电池在外加电压时可发生电解过程。第7页,共29页，2024年2月25日，星期天酶的高度纯化之正负电荷法阳膜：只允许阳离子通过阴膜：只允许阴离子通过结果：阴极室溶液呈？性，阳极室溶液呈？性电渗析（electrodialysis【ED】）第8页,共29页，2024年2月25日，星期天酶的高度纯化之正负电荷法升级版第9页,共29页，2024年2月25日，星期天酶的高度纯化之正负电荷法

电渗析与电解不同之处在于：电渗析的电压虽高，电流并不大，维持不了连续的氧化还原反应所需；电解却正好相反。思考：电渗析与电解的区别？第10页,共29页，2024年2月25日，星期天酶的高度纯化之正负电荷法电渗析主要用于酶液或其他带电荷小分子的分离，也可以将凝胶电泳后的含蛋白质或核酸等的凝胶切开，置于中心室，经过电渗析，使带电荷的大分子从凝胶中分离出来第11页,共29页，2024年2月25日，星期天酶的高度纯化之正负电荷法电渗析技术在生活中有着重要应用，如化工脱盐，海水淡化，食品医药，废水处理，在某些地区成为饮用水的重要生产方法。

优点：具有能量消耗少，经济效益显著，装置和系统应用灵活方便，操作简便，不污染环境，装置使用时间长，原水回收率高等优点。第12页,共29页，2024年2月25日，星期天酶的高度纯化之正负电荷法电泳分离定义：带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳（electrophoresis）。利用带电粒子在电场中泳动的方向和泳动速率的不同，而使组分分离的技术过程就是电泳分离。第13页,共29页，2024年2月25日，星期天酶的高度纯化之正负电荷法电泳分离纸层电泳薄膜电泳薄层电泳凝胶电泳自由电泳等电聚焦电泳区带电泳移界电泳稳态电泳按介质按原理等速电泳等电聚焦电泳第14页,共29页，2024年2月25日，星期天酶的高度纯化之正负电荷法区带电泳：

是在一定的支持物上，于均一的载体电解质中，将样品加在中部位置，在电场作用下，样品中带正或负电荷的离子分别向负或正极以不同速度移动，分离成一个个彼此隔开的区带。区带电泳按支持物的物理性状不同，又可分为纸和其他纤维膜电泳、粉末电泳、凝胶电泳与丝线电泳。第15页,共29页，2024年2月25日，星期天酶的高度纯化之正负电荷法第16页,共29页，2024年2月25日，星期天酶的高度纯化之正负电荷法移动界面电泳：

是将被分离的离子（如阴离子）混合物置于电泳槽的一端（如负极），在电泳开始前，样品与载体电解质有清晰的界面。电泳开始后，带电粒子向另一极（正极）移动，泳动速度最快的离子走在最前面，其他离子依电极速度快慢顺序排列，形成不同的区带。只有第一个区带的界面是清晰的，达到完全分离，其中含有电泳速度最快的离子，其他大部分区带重叠。第17页,共29页，2024年2月25日，星期天酶的高度纯化之正负电荷法第18页,共29页，2024年2月25日，星期天酶的高度纯化之正负电荷法等速电泳：

是在样品中加有领先离子（其迁移率比所有被分离离子的大）和终末离子（其迁移率比所有被分离离子的小），样品加在领先离子和终末离子之间，在外电场作用下，各离子进行移动，经过一段时间电泳后，达到完全分离。被分离的各离子的区带按迁移率大小依序排列在领先离子与终末离子的区带之间。由于没有加入适当的支持电解质来载带电流，所得到的区带是相互连接的（图d），且因“自身校正”效应，界面是清晰的，这是与区带电泳不同之处。第19页,共29页，2024年2月25日，星期天酶的高度纯化之正负电荷法等电聚焦电泳：等电点？在某一PH的溶液中，氨基酸或蛋白质解离成阳离子和阴离子的趋势或程度相等，成为兼性离子，呈电中性，此时溶液的pH成为该氨基酸或蛋白质的等电点。第20页,共29页，2024年2月25日，星期天酶的高度纯化之正负电荷法等电聚焦电泳：

是将两性电解质加入盛有pH梯度缓冲液的电泳槽中，当待分离的酶或其他蛋白溶液泳动到其自身特有的等电点时，其净电荷为零，泳动速度下降到零，具有不同等电点的物质最后聚焦在各自等电点位置，形成一个个清晰的区带，分辨率极高。第21页,共29页，2024年2月25日，星期天酶的高度纯化之正负电荷法区带电泳移界电泳等速电泳等电聚焦思考：PAGE属于上述哪个？第22页,共29页，2024年2月25日，星期天酶的高度纯化之正负电荷法层析聚焦聚焦层析是将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析的特性结合在一起，实现组分分离的技术。第23页,共29页，2024年2月25日，星期天酶的高度纯化之正负电荷法层析聚焦聚焦层析是利用层析过程中固定相偶联具有两性解离功能的有机分子为配基，与流动相中某些具有两性粒子发生等电聚焦反应而进行分离的一种方法。第24页,共29页，2024年2月25日，星期天酶的高度纯化之正负电荷法聚焦层析也是一种柱层析。因此，它和另外的层析一样，照例具有流动相，其流动相为多缓冲剂，固定相为多缓冲交换剂。第25页,共29页，2024年2月25日，星期天酶的高度纯化之正负电荷法步骤：。（1）加有两性电解质载体的多缓冲溶液流经多缓冲离子交换剂形成稳定pH梯度。第26页,共29页，2024年2月25日，星期天酶的高度纯化之正负电荷法步骤：第27页,共29页，2024年2月25日，星期天酶的高度纯化之正负电荷法制作pH6—9的梯度：

（1）使用时，将多元缓冲剂pH值调到9（初始pH）（2）将多元缓冲液(pH6-9)调到7(极限pH)(3)用（