酶工程学第十十一周固定化

酶工程学第十十一周固定化第一节概述第二节固定化酶的性质及其影响因素第三节固定化酶的制备第四节固定化细胞第五节固定化辅酶和原生质体第六节酶反应器和固定化酶（细胞）的应用内容提要第2页,共92页，2024年2月25日，星期天图6-1生物催化剂作用方式示意生物催化剂细胞酶非生长生长可溶固定化悬浮固定化连续间歇吸附包埋交联化学连续材料膜固定酶液凝胶吸附化学连接物固定化再循环系统凝胶吸附连续半连续分批间歇连续活塞模式搅拌连续反应器间歇连续活塞模式搅拌连续反应器第3页,共92页，2024年2月25日，星期天第一节概述游离酶的缺点：1.酶的稳定性较差，在温度、pH、和无机离子等外界因素的影响下，容易变性失活。2.酶一般都是在水溶液中与底物反应，反应结束后酶难以回收。3.反应结束后，酶成为产物的杂质。第4页,共92页，2024年2月25日，星期天固定化酶：固定化酶是指固定在载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶。固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游离酶的不足之处，具有增强稳定性，可反复或连续使用以及易于和反应产物分开等显著特点。直接固定菌体或菌体碎片的，称为固定化菌体或固定化死细胞。第5页,共92页，2024年2月25日，星期天水溶性酶水不溶性载体水不溶性酶（固定化酶）固定化技术第6页,共92页，2024年2月25日，星期天固定化酶的优缺点多次使用可以装塔连续反应优点：纯化简单提高产物质量应用范围广缺点：首次投入成本高大分子底物较困难第7页,共92页，2024年2月25日，星期天第二节固定化酶的制备一、一般方法及特点二、酶的固定化方法第8页,共92页，2024年2月25日，星期天一、选择方法依据：（1）酶的性质（2）载体的性质（3）制备方法的选择第9页,共92页，2024年2月25日，星期天二、酶的固定化方法（一）吸附法（二）结合法（三）交联法（四）包埋法第10页,共92页，2024年2月25日，星期天（一）吸附法1.物理吸附：利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上。

选择载体的原则：（1）要有巨大的比表面积（2）要有活泼的表面（3）便于装柱进行连续反应。第11页,共92页，2024年2月25日，星期天常用载体：活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石优点：缺点：结合力不劳、容易脱落。吸附法常用的载体及优、缺点操作简单、条件温和、载体廉价易得、可反复使用。第12页,共92页，2024年2月25日，星期天（二）结合法离子键结合法共价键结合法定义：选择适宜载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法称为结合法。第13页,共92页，2024年2月25日，星期天1.离子键结合法概念：通过共价键将酶与载体结合的固定化方法。常用载体:DEAE-纤维素，DEAE-葡聚糖凝胶使用注意：pH、离子强度、温度++++++++++++----------------++++++++第14页,共92页，2024年2月25日，星期天2.共价键结合法概念：通过共价键将酶与载体结合的固定化方法。可以形成共价键的基团：游离氨基，游离羧基，巯基，咪唑基，酚基，羟基，甲硫基，吲哚基，二硫键常用载体：天然高分子、人工合成的高聚物、无机载体第15页,共92页，2024年2月25日，星期天共价键结合法制备固定化酶的“通式”首先载体上引进活泼基团然后活化该活泼基团最后此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键第16页,共92页，2024年2月25日，星期天载体活化的方法A．重氮法B．叠氮法C．烷基化反应法D．硅烷化法E．溴化氰法第17页,共92页，2024年2月25日，星期天A．重氮法反应式：第18页,共92页，2024年2月25日，星期天目前在我们国内用的较多的载体：该方法需要载体具有芳香族氨基氨基苯磺酰乙基（ABSE）纤维素琼脂糖葡聚糖凝胶琼脂……第19页,共92页，2024年2月25日，星期天反应式及原理第20页,共92页，2024年2月25日，星期天B叠氮法例：用羧甲基纤维素叠氮衍生物制备固定化胰蛋白酶步骤如下：酯化肼解叠氮化偶联第21页,共92页，2024年2月25日，星期天C．烷基化反应法含羟基的载体可用三氯三嗪等多卤代物进行活化，形成含有卤素基团的活化载体。第22页,共92页，2024年2月25日，星期天D．硅烷化法载体特点：①机械强度好，表面积大。②耐有机溶剂和微生物破坏。载体可以再生，寿命长等。常用的载体：多孔玻璃，多孔陶瓷。第23页,共92页，2024年2月25日，星期天第24页,共92页，2024年2月25日，星期天第25页,共92页，2024年2月25日，星期天第26页,共92页，2024年2月25日，星期天E．溴化氰法本方法主要用溴化氰（CNBr）活化多糖类物质。如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等，其中以琼脂糖为载体的占多数（大孔网状结构）。用溴化氰法活化琼脂糖制备得到的固定化酶目前使用很广，特别用作亲和层析，有着良好的性能。第27页,共92页，2024年2月25日，星期天第28页,共92页，2024年2月25日，星期天（三）交联法定义：借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。第29页,共92页，2024年2月25日，星期天1.交联法常用试剂戊二醛己二胺顺丁烯二酸酐双偶氮苯4,4ˊ-双(二甲氨基)偶氮苯第30页,共92页，2024年2月25日，星期天2.交联法的形式交联法有2种形式：酶直接交联法酶辅助蛋白交联法第31页,共92页，2024年2月25日，星期天酶直接交联法：在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。固定化依赖酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间的平衡。EEEEEE第32页,共92页，2024年2月25日，星期天酶辅助蛋白交联法：为避免分子内交联和在交联过程中因化学修饰而引起酶失活，可使用第二个"载体"蛋白质（即辅助蛋白质，如白蛋白、明胶、血红蛋白等）来增加蛋白质浓度，使酶与惰性蛋白质共交联。EEE第33页,共92页，2024年2月25日，星期天（四）包埋法定义：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。琼脂琼脂糖海藻酸钠角叉菜胶明胶聚丙烯酰胺……载体：第34页,共92页，2024年2月25日，星期天1．网格型定义：将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网格中，制成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也称为凝胶包埋法。第35页,共92页，2024年2月25日，星期天2．微囊型包埋法定义：将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直径一般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。第36页,共92页，2024年2月25日，星期天微囊化法制备固定化酶有两种方法界面沉淀法：利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度较低而形成的皮膜将酶包埋。界面聚合法：是用化学手段制备微囊的方法。利用油水界面上发生聚合反应形成聚合体而将酶包裹起来。癸二酰氯，氯仿酶，水，乙二胺第37页,共92页，2024年2月25日，星期天第三节固定化酶的性质及其影响因素一、影响固定化酶性质的因素二、固定化后酶性质的变化三、评价固定化酶的指标第38页,共92页，2024年2月25日，星期天一、影响固定化酶性质的因素1．酶本身的变化，主要是由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生了变化。2．载体的影响（1）分配效应（2）空间障碍效应（3）扩散限制效应3.固定化方法的影响第39页,共92页，2024年2月25日，星期天二、固定化后酶性质的变化1．固定化对酶活性的影响：酶活性下降，反应速度下降原因：酶结构的变化空间位阻2．固定化对酶稳定性的影响（1）操作稳定性提高（2）贮存稳定性比游离酶大多数提高。（3）对热稳定性，大多数升高，有些反而降低。（4）对分解酶的稳定性提高。（5）对变性剂的耐受力升高第40页,共92页，2024年2月25日，星期天三、固定化后酶稳定性提高的原因固定化后酶分子与载体多点连接。酶活力的释放是缓慢的。抑制自降解，提高了酶稳定性。第41页,共92页，2024年2月25日，星期天四、pH的影响

（一）pH对酶活性的影响：（1）改变酶的空间构象（2）影响酶的催化基团的解离（3）影响酶的结合基团的解离（4）改变底物的解离状态，酶与底物不能结合或结合后不能生成产物。第42页,共92页，2024年2月25日，星期天（二）pH对固定化酶的影响1.载体带负电荷，pH向碱性方向移动。2.载体带正电荷，pH向酸性方向移动。

微环境是指在固定化酶附近的局部环境，而把主体溶液称为宏观环境。第43页,共92页，2024年2月25日，星期天催化反应的产物为酸性时，固定化酶的pH值比游离酶的pH值高。催化反应的产物为碱性时，固定化酶的pH值比游离酶的pH值低。（三）产物性质对体系pH的影响第44页,共92页，2024年2月25日，星期天（四）最适温度变化作用于低分子底物的酶，特异性没有明显变化既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶，特异性往往会变化。一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化。（五）底物特异性变化第45页,共92页，2024年2月25日，星期天（六）米氏常数Km的变化，Km值随载体性质变化（1）载体与底物带相同电荷，Km’>Km固定化酶降低了酶的亲和力。（2）载体与底物电荷相反，静电作用，Km’<Km。第46页,共92页，2024年2月25日，星期天五、评价固定化酶的指标：1.酶活定义（IU)：在特定条件下，每一分钟催化一个微摩尔底物转化为产物的酶量定义为1个酶活单位。2.酶比活定义（游离）：每毫克酶蛋白或酶RNA（DNA)所具有的酶活力单位（一）游离酶第47页,共92页，2024年2月25日，星期天1.固定化酶的比活：

每（克）干固定化酶所具有的酶活力单位。或：单位面积（cm2）的酶活力单位表示（酶膜、酶管、酶板）。2.操作半衰期：

连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需要的时间（t1/2），是衡量稳定性的指标。（二）固定化酶第48页,共92页，2024年2月25日，星期天5.相对酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶活力

3.4.酶活力回收率也称偶联效率，活力保留百分数。第49页,共92页，2024年2月25日，星期天六、固定化酶的活力测定方法介绍1.振荡测定法：2.酶柱测定法：3.连续测定法：利用连续分光光度法等测定方法可以对固定化酶反应液进行连续测定，从而测定固定化酶的酶活力。第50页,共92页，2024年2月25日，星期天第四节微生物、植物和动物细胞固定化细胞特性比较细胞种类植物细胞微生物细胞动物细胞细胞大小/um20-3001-1010-100倍增时间/h>120.3-6>15营养要求简单简单复杂光照要求大多数要光照不要求不要求对剪切力敏感大多数不敏感敏感主要产物色素、药物、香精、酶等醇、有机酸、氨基酸、抗生素、核苷酸、酶疫苗、激素、抗体、酶第51页,共92页，2024年2月25日，星期天固定化细胞定义：固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞称为固定化细胞.该细胞能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢，又称固定化活细胞或固定化增殖细胞。第52页,共92页，2024年2月25日，星期天固定化细胞的特点类型：微生物细胞、植物细胞、动物细胞生理状态：死细胞（完整细胞、细胞碎片、细胞器）活细胞（增殖细胞、静止细胞、完整细胞）形状：颗粒状、块状、条状、薄膜状或不规则形状。

使用周期：理论上讲，固定化增殖细胞保持了细胞原有的全部活性，只要载体不解体，不污染就可以长期使用。第53页,共92页，2024年2月25日，星期天细胞固定化方法吸附法包埋法第54页,共92页，2024年2月25日，星期天吸附法定义：通过载体与细胞间的静电引力，即细胞表面与载体之间范德华作用力，离子键和氢键作用力，才使细胞固定在载体上的。pH3－5------------++++++++第55页,共92页，2024年2月25日，星期天影响吸附法的主要因素

Z-电位：Z-电位能近似地代表表面电荷密度的大小细胞的性质和细胞壁的组成：细胞壁的电荷性质载体的性质：特别是玻璃、陶瓷等无机材料第56页,共92页，2024年2月25日，星期天包埋固定法

包理法是在细胞自身并不与凝胶基体发生化学键合的情况下将其包埋在半透性聚合物颗粒（或膜）内的一种固定化方法。包埋法的最大优点是能较好的保持细胞内多酶系统的活力，可象游离细胞那样进行产物的发酵生产。第57页,共92页，2024年2月25日，星期天包埋法常用载体：琼脂海藻酸钙角叉菜胶明胶聚丙烯酰胺第58页,共92页，2024年2月25日，星期天举例：海藻酸钙包埋法基本原理是：称取一定量的海藻酸钠配成水溶液，经杀菌冷却后，与一定体积的细胞或孢子悬浮液混合均匀，然后用注射器或滴管将冷悬液滴入一定浓度的凝固浴中（常用CaCl2

溶液），形成球状固定化细胞。第59页,共92页，2024年2月25日，星期天研究热点——光交联树脂包埋法

例：相对分子量为1000-3000的光交联聚氨酯预聚物等，加入1%左右的光敏剂，加水配成一定浓度，加热至50℃，然后与一定浓度的细胞悬浮液混合均匀，摊成一定厚度的薄层，用紫外照射3min，就可制得。第60页,共92页，2024年2月25日，星期天第五节固定化原生质体和辅酶一、原生质体的制备二、固定化三、辅酶固定化第61页,共92页，2024年2月25日，星期天一、原生质体的制备将对数生长期的细胞收集——悬浮在含有渗透压稳定剂的高渗缓冲液中——加入水解酶——分离——得到原生质体第62页,共92页，2024年2月25日，星期天二、原生质体固定化的方法将原生质替制备好后，把离心收集到的原生质体重新悬浮在含有渗透压稳定剂的缓冲液中，配成一定浓度的原生质体悬浮液，然后采用包埋法制成固定化原生质体。第63页,共92页，2024年2月25日，星期天三、辅酶固定化原因有机辅因子中具有某些特殊的化学基团，参与酶的催化反应有机辅因子在使用过程中要流失，并且不能自行再生有机辅因子价格昂贵——工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留和再生第64页,共92页，2024年2月25日，星期天辅酶固定化的方法固定化方法与酶相似，一般采用溴化氰法，碳二亚胺法以及重氮偶联法等共价偶联，或将其进行适当的化学修饰后固定在超滤器中。辅酶固定化必须解决辅酶在多个酶之间传递的障碍。

第65页,共92页，2024年2月25日，星期天辅酶的固定化第66页,共92页，2024年2月25日，星期天第67页,共92页，2024年2月25日，星期天辅酶固定化的形式第68页,共92页，2024年2月25日，星期天第六节酶反应器和固定化酶（细胞）的应用酶反应器介绍反应器选择的依据反应器和酶稳定性固定化酶和细胞的应用（工农业、医药、分析化学、酶电极、亲和色谱、环境保护、能源开发、基础理论研究）第69页,共92页，2024年2月25日，星期天一、酶反应器1．分批搅拌反应器。2．连续流搅拌桶反应器。3．连续搅拌桶-超滤反应器4．填充床反应器5．循环反应器6．流化床反应器定义：用于各种酶进行催化反应的容器及其附属设备。类型：第70页,共92页，2024年2月25日，星期天1．分批搅拌反应器反应器结构简单，不需要特殊装置，适与小规模试验第71页,共92页，2024年2月25日，星期天2．连续流搅拌桶反应器第72页,共92页，2024年2月25日，星期天3．连续搅拌桶-超滤反应器酶循环第73页,共92页，2024年2月25日，星期天4．填充床反应器第74页,共92页，2024年2月25日，星期天5．循环反应器第75页,共92页，2024年2月25日，星期天6．流化床反应器与连续流搅拌桶式反应器类似，是让适量的颗粒状酶悬浮于反应床中，不用搅拌器，而是底物向上流过固定酶床，因此流速要适当控制。第76页,共92页，2024年2月25日，星期天反应器选择酶的形式：底物的物理性质：酶反应动力学酶的稳定性操作要求、应用和可塑性成本第77页,共92页，2024年2月25日，星期天反应器和酶的稳定性反应器中酶催化活性损失的原因：酶本身失效酶从载体上脱落载体肢解扩散限制效应第78页,共92页，2024年2月25日，星期天二、固定化酶（细胞）的应用1.

固定化酶（细胞）在工农业生产上的应用2．固定化酶在医药治疗上的应用3．固定化酶在分析化学中应用4．固定化酶和亲和色谱5．固定化酶与环境保护6．新能源开发中的应用7．固定化酶在基础理论研究中应用第79页,共92页，2024年2月25日，星期天1．固定化酶（细胞）在工农业生产上的应用葡萄糖异构酶——世界上生产规模最大的一种固定化酶。利用固定化乳糖酶可以连续生产低乳糖奶固定化酵母细胞等微生物可用于生产各种酒类热点：固定化原生质体的应用第80页,共92页，2024年2月25日，星期天2．固定化酶在医药治疗上的应用例1固定化青霉素酰化酶，只要改变pH值等条件，就可以生成不同的产物。第81页,共92页，2024年2月25日，星期天青霉素酰化酶催化合成头孢类抗生素

7-ACAasnucleus第82页,共92页，2024年2月25日，星期天7-ACCAor7-ADCAasnuc