酵母RNA的提取鉴定和定量测定实验十

酵母RNA的提取鉴定和定量测定实验十实验目的

1、学习RNA提取的几种常用方法并掌握浓盐法提取RNA的原理和方法。

3、掌握几种定性鉴定所得RNA的原理与方法。

4、掌握两种定量测定所得RNA的原理和方法。

5、学习电泳技术的基本原理及其分类以及相关的应用。

第2页,共42页，2024年2月25日，星期天Ⅰ提纯部分浓盐法提取酵母RNAⅡ定性鉴定部分一、RNA基团鉴定二、电泳分离鉴定三、光谱鉴定四、纯度鉴定Ⅲ定量测定部分一、地衣酚法定量测定二、紫外吸收法定量测定实验内容第3页,共42页，2024年2月25日，星期天RNA提取和定性定量分析RNA的提取RNA定性分析RNA定量测定第4页,共42页，2024年2月25日，星期天第5页,共42页，2024年2月25日，星期天生物大分子物质提取的基本原理与步骤一、材料选择与处理二、细胞破碎三、细胞器分离四、提取五、纯化六、浓缩、干燥七、样品保存八、定性鉴定九、定量测定10、物质的利用第6页,共42页，2024年2月25日，星期天核酸的分布DNA：细胞核（95%）细胞器（5%）

RNA：细胞质（75%)

细胞核(10%)

细胞器(15%)RNA以rRNA的数量最多（80％-85%)第7页,共42页，2024年2月25日，星期天核酸提取的主要步骤破碎细胞去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子去除其它不需要的核酸分子沉淀核酸，去除盐类，有机溶剂等杂质第8页,共42页，2024年2月25日，星期天核酸分离纯化原则保证核酸一级结构的完整性排除其它分子的污染

简化操作，缩短时间，以减少各种有害因素对核酸的破坏减少化学因素对核酸的降解(pH4-10)减少物理因素对核酸的降解(机械剪切力、高温)防止核酸的生物降解(DNA酶、RNA酶)

第9页,共42页，2024年2月25日，星期天实验原理

由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也各异，一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验室最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被苯酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在苯酚层中，向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出。此法能较好地除去DNA和蛋白质，提取的RNA具有生物活性。

酵母细胞富含核酸，且核酸主要是RNA，含量为干菌体的2.67%-10.0%，而DNA含量较少，仅为0.03%-0.516%。为此提取RNA多以酵母为原料。工业上制备RNA多选用低成本、适于大规模操作的稀碱法或浓盐法。这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备单核苷酸的原料，其工艺比较简单。第10页,共42页，2024年2月25日，星期天

稀碱法是用氢氧化钠使酵母细胞壁变性、裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。提取的RNA有不同程度的降解。

浓盐法是用高浓度盐溶液处理，同时加热，以改变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释放出来。第11页,共42页，2024年2月25日，星期天RNA提取方法方法与分类稀碱法(0.2%NaOH)浓盐法(10%NaCl)苯酚法氯仿-异戊醇法去污剂法盐酸胍法第12页,共42页，2024年2月25日，星期天三、试剂和器材

1、试剂（1）干酵母粉（2）RNA标准溶液（100微克/毫升）（8）5%硝酸银溶液（9）钼酸铵试剂2克钼酸铵溶解在100毫升10%硫酸中。（10）地衣酚试剂：100毫升浓盐酸加入100毫克三氯化铁，摇匀，贮存备用，使用前加入100毫克地衣酚。（11）NaCl（12）95%乙醇（13）6mol/lHCl（14）高氯酸（15）氯化锂（16）硼酸缓冲液（pH-3.5）（17）磷酸缓冲液（pH-7.5）第13页,共42页，2024年2月25日，星期天2、器材

（1）电子天平（2）电热套（3）三角烧瓶（4）烧杯（5）高速冷冻离心机（6）滴管

（7）抽滤瓶（8）离心管（9）恒温水浴箱

（10）吸量管（11）紫外分光光度计

（12）表面皿（13）量筒(14）容量瓶（15）擦镜纸（16）比色皿（17）玻棒（18）定量滤纸（19）试管

（20）布氏漏斗（21）真空泵（22）电泳仪（23）紫外检测仪（24）可见光分光光度计（25）托盘天平（26）电泳槽(27)0.5-5.0精密pH试纸第14页,共42页，2024年2月25日，星期天

四、实验方法

RNA的提取的操作

第15页,共42页，2024年2月25日，星期天3、RNA提取方法(浓盐法)

提取方案：①取12g活性干酵母,置150ml锥形瓶中，加入60ml蒸馏水，混匀；

②倒入7gNaCl，溶解后，沸水浴1h；

③3500rpm离心8min，将上清倒入50ml烧杯中，

4)用HCl调节pH，至2.0～2.5；

第16页,共42页，2024年2月25日，星期天④将烧杯冰浴10min；⑤将烧杯中物质（含沉淀）移入离心管中，3500rpm离心8min，弃上清，将沉淀移入10ml烧杯中，95%乙醇5～10ml洗涤⑥用布氏漏斗真空抽滤⑧干燥，称重，计算提取率（并保存好RNA）第17页,共42页，2024年2月25日，星期天思考题

1、简述生物大分子物质提取和纯化的一般步骤。2、RNA提取过程中的关键步骤及注意事项有哪些？3、简述浓盐法提取RNA过程中的关键步骤及注意事项。第18页,共42页，2024年2月25日，星期天RNA含量测定之一：地衣酚法

第19页,共42页，2024年2月25日，星期天RNA的地衣酚法定量测定原理

RNA含量测定之一：地衣酚法测定。反应原理：当RNA与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变成糠醛，后者与3，5-二羟基甲苯（地衣酚

orcinol）反应，在Fe3+或Cu2+催化下，生成鲜绿色复合物。反应产物在670nm处有最大吸收。RNA浓度在20-250μg/ml范围内，光密度与RNA浓度成正比。第20页,共42页，2024年2月25日，星期天λmax=670nmA、核糖鉴定：RNAH2SO4100℃第21页,共42页，2024年2月25日，星期天（1）标准曲线的制作

取6支试管，7按下表编号及加入试剂，加毕混匀，置沸水浴中加热45min，取出冷却，于670nm波长处测定光密度值。

管号试剂012345标准RNA溶液（ml）(100g/ml)00.40.81.21.62.0蒸馏水（ml）2.01.61.20.80.40地衣酚试剂（ml）2.02.02.02.02.02.0第22页,共42页，2024年2月25日，星期天（2）样品的测定准确称取0.1g提取的酵母RNA，放入小烧杯中，加少量蒸馏水调成糊状，溶解，若不溶，则滴入少量5%-6%氨水助溶，调pH至7.0，小心转移到25ml容量瓶中，用蒸馏水定容到刻度，混匀。取1.0ml样品液稀释40倍后，分别取2份2.0ml的稀释液，加入2.0ml的地衣酚试剂，混匀，与标准曲线的各管同时置沸水浴中加热45分钟，冷却，测定O.D670。第23页,共42页，2024年2月25日，星期天（3）RNA含量的计算根据测得的O.D值，从标准曲线上查出相对应的RNA含量，按下式计算出制品中RNA的百分含量：RNA%=第24页,共42页，2024年2月25日，星期天RNA鉴定之一：组成基团的鉴定第25页,共42页，2024年2月25日，星期天RNA含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸组分，加硫酸煮沸可使其水解，用硝酸银、地衣酚和定磷试剂可分别鉴定嘌呤碱、核糖和磷酸组分。

A、嘌呤鉴定：嘌呤

嘌呤银化物（白色或红棕色）AgNO3RNAH2SO4100℃第26页,共42页，2024年2月25日，星期天实验步骤:取适量0.05g提取的RNA，加10%硫酸液3ml，放在沸水浴中加热5分钟，制成RNA水解，做以下鉴定（1）嘌呤碱基的检查

取水解液0.5ml，加氨水0.5ml及5%硝酸银溶液0.3ml，观察是否产生絮状嘌呤银化合物（有时絮状物出现较慢，可放置十几分钟）。

第27页,共42页，2024年2月25日，星期天第28页,共42页，2024年2月25日，星期天（2）磷酸的检查

取水解液0.5ml，加2滴浓硝酸酸化，再加入0.5ml钼酸铵试剂，放在沸水浴中加热10分钟，冷却静置后观察是否有黄色磷钼酸铵沉淀产生。

（3）核糖的检查

取水解液0.5ml，加地衣酚试剂0.5ml，放在沸水浴中加热5分钟，观察溶液颜色变化。第29页,共42页，2024年2月25日，星期天操作方法

用分析天平准确称取待测的样品RNA0.150g，加入少量的蒸馏水调成糊状，再加入少量的水稀释。用5%---6%的氨水调至pH值为7.0，定容到10ml(RNA的鉴定三和四皆用该溶液,不过要稀释200倍)。

RNA的定量分析之二：

紫外吸收法测定核酸浓度

第30页,共42页，2024年2月25日，星期天

取两支离心管，向第一支管中加入2ml样品溶液和2ml蒸馏水。第二支管中加入2ml样品溶液和2ml沉淀剂。混匀。在冰浴中放置30分钟，然后离心10分钟，3000转/分钟。从各管中取出0.25ml上清液，用蒸馏水定容到25ml。于260nm处测定其光吸收值（OD1、OD2）第31页,共42页，2024年2月25日，星期天

将样品放于紫外分光光度计上测定260nm,

计算核酸浓度。

OD1—OD2

RNA%=

0.022

×100

样品浓度

式中：OD260为260nm波长处光密度读数；L为比色杯的厚度；0.022为每毫升溶液内含

1微克RNA的光密度。第32页,共42页，2024年2月25日，星期天RNA的鉴定三：提取的RNA吸收光谱测定

核酸在240~290nm的紫外波段有一强烈的吸收峰，最大吸收值在260nm附近。不同的核酸有不同的吸收特征。所以可以用紫外分光光度计加以定性和定量。

操作:取RNA的定量分析之二所配溶液0.5ml,稀释200倍,取3ml测定不同波长(230、240、250260、270、280、290、300、310nm)下的OD值,以不同波长为横坐标,OD值为纵坐标绘制RNA吸收光谱曲线。第33页,共42页，2024年2月25日，星期天RNA的鉴定四：提取的RNA纯度的判断

纯DNA的OD260/OD280应大于1.8，而纯RNA的OD260/OD280应达到2.0。如果样品中含又杂蛋白、苯酚，则OD260/OD280的比值会明显降低。所以我们通过测定OD260/OD280的比值来检测RNA的纯度。

操作:

取RNA的定量分析之二所配溶液0.5ml,稀释200倍,取3ml于比色皿中分别在260nm、280nm处测定其光吸收值（OD1、OD2）根据测得的OD值判断提取的RNA的纯度。第34页,共42页，2024年2月25日，星期天

剂i]

1、推入黑体遮光预热2、在“T”位置调“0”3、在“T”位置调

“100”4、按到“A”位置测定UV-2000第35页,共42页，2024年2月25日，星期天

RNA的鉴定之二：

醋酸纤维素薄膜电泳分离鉴定

第36页,共42页，2024年2月25日，星期天

1、RNA的碱水解：称取0.15克RNA，溶于5mL0.3mol/L氢氧化钾溶液中，使RNA的浓度达到20-30mg/ml。沸水浴30min

或者在37℃水解18个小时。将水解液转移到椎形瓶中。冰浴中用高氯酸溶液将水解液滴定到pH3.5。2000r/min离心10min，上清液即是样品液。第37页,共42页，2024年2月25日，星期天２、准备与点样(1)将薄膜切成2.5cm×8cm的小片。在薄膜无光泽面(正面)的一端约2cm处用硬铅笔划一点样线。(2)将薄膜无光泽面向下，置PH3.5,0.02mol/L的柠檬酸缓冲液中浸湿。第38页,共42页，2024年2月25日，星期天(3)将充分浸透的膜条取出，用滤纸吸去多余的缓冲液，把膜条置洁净玻璃板上，无光泽面朝上。用点样器在距膜条一端