酶工程在医药工业中的应用

酶工程在医药工业中的应用酶促反应的专一性强，反应条件温和。酶工程的优点是工艺简单、效率高、生产成本低、环境污染小，而且产品收率、纯度高，还可制造出化学法无法生产的产品。以下重点介绍固定化酶技术在制药工业中生产抗生素、核苷酸和氨基酸的应用。第2页,共43页，2024年2月25日，星期天1.固定化细胞法生产6-氨基青霉烷酸2.固定化酶法生产5’-复合单核苷酸3.固定化酶法生产L-氨基酸第3页,共43页，2024年2月25日，星期天1.固定化细胞法生产6-氨基青霉烷酸青霉素G(或V)经青霉素酰化酶作用，水解除去侧链后的产物称为6-氨基青霉烷酸(6-APA)，也称无侧链青霉素。第4页,共43页，2024年2月25日，星期天6-APA是生产半合成青霉素的最基本原料，到目前为止，以6-APA为原料已合成近3万种衍生物，并已筛选出数十种耐酸、耐酶、低毒及具有广谱抗菌作用的半合成青霉素。第5页,共43页，2024年2月25日，星期天1．技术路线固定化细胞法生产6-氨基青霉烷酸的技术路线第6页,共43页，2024年2月25日，星期天2．工艺过程(1)大肠杆菌培养(2)

E．coli固定化(3)固定化E．coli反应堆制备(4)转化反应(5)6-APA的提取第7页,共43页，2024年2月25日，星期天青霉素酰化酶转化流程图1.酶反应器；2．pH凋节罐；3．热水罐；4．碱液罐；5.热水循环泵；6．裂解液循环泵；7．流量计；8.自动pH计；9．自动记录温度计；10．酶反应器温度计第8页,共43页，2024年2月25日，星期天大肠杆菌培养

斜面培养基：普通肉汁琼脂培养基；发酵培养基：蛋白胨2％，NaCl0.5％，苯乙酸0.2％，自来水配制。用2mol/LNaOH溶液调pH7.0，在55.16kPa压力下灭菌30min后备用。第9页,共43页，2024年2月25日，星期天将斜面接种后培养18～30h的E．ColiD816(产青霉素酰化酶)，用15mL无菌水制成菌细胞悬液；取1mL悬浮液接种至装有30mL发酵培养基的三角烧瓶（250mL）中，在摇床上28℃，170r/min振荡培养15h，如此依次扩大培养，直至1000～2000L。第10页,共43页，2024年2月25日，星期天规模通气搅拌培养。培养结束后用高速管式离心机离心收集菌体，备用。第11页,共43页，2024年2月25日，星期天E．coli固定化

取E.coli湿菌体100kg，置于40℃反应罐中，在搅拌下加入50L10％明胶溶液，搅拌均匀后加入25％戊二醛5L，再转移至搪瓷盘中，使之成为3～5cm厚的液层，室温放置2h，再转移至4℃冷库过夜；第12页,共43页，2024年2月25日，星期天待形成固体凝胶块后，通过粉碎和过筛，使其成为直径为2mm左右的颗粒状固定化E．coli细胞，用蒸馏水及pH7.5、0.3mol/L磷酸缓冲液先后充分洗涤，抽干，备用。第13页,共43页，2024年2月25日，星期天固定化E．Coli反应堆制备

生物反应堆：将酶或细胞进行固定化处理，再将固定化酶或细胞装填于适当反应器中制成的填充式反应器。第14页,共43页，2024年2月25日，星期天将上述充分洗涤后的固定化E．Coli细胞(产青霉素酰化酶)装填于带保温夹套的填充床式反应器中，即成为固定化E．coli反应堆（反应器规格为Ф70cm×160cm）。第15页,共43页，2024年2月25日，星期天转化反应

取20kg青霉素G(或V)钾盐，加入到1000L配料罐中，用0.03mol/L、pH7.5的磷酸缓冲液溶解并使青霉素钾盐浓度为3％，用2mol/LNaOH溶液调pH至7.5～7.8；

第16页,共43页，2024年2月25日，星期天然后，将反应器及pH调节罐中反应液温度升到40℃，维持反应体系的pH在7.5～7.8范围内，以70L/min流速使青霉素钾盐溶液通过固定化E．Coli

反应堆进行循环转化，直至转化液pH不变为止。循环时间一般为3～4h。反应结束后，放出转化液。第17页,共43页，2024年2月25日，星期天6-APA的提取

上述转化液经过滤澄清后，滤液用薄膜浓缩器减压浓缩至100L左右；冷却至室温后，于250L搅拌罐中加50L醋酸丁酯充分搅拌提取10～15min（萃取）；第18页,共43页，2024年2月25日，星期天取下层水相，加1％g/mL活性炭于70℃搅拌脱色30min，滤除活性炭；滤液用6mol/L盐酸调pH至4.0左右，5℃放置结晶过夜；次日滤取结晶，用少量冷水洗涤，抽干，115℃烘2～3h，得成品6-APA。按青霉素G计，收率一般为70％～80％。第19页,共43页，2024年2月25日，星期天2.固定化酶法生产5’-复合单核苷酸4种5’-复合单核苷酸注射液可用于治疗白血球下降、血小板减少及肝功能失调等疾病。核糖核酸(RNA)经5’-磷酸二酯酶作用可分解为腺苷、胞苷、尿苷及鸟苷的一磷酸化合物，即AMP、CMP、UMP，及GMP。

第20页,共43页，2024年2月25日，星期天5’-磷酸二酯酶存在于桔青霉细胞、谷氨酸发酵菌细胞及麦芽根等生物材料中。实验以麦芽根为材料制取5’-磷酸二酯酶，并使其固定化后用于水解酵母RNA，以生产5’-复合单核苷酸注射液。第21页,共43页，2024年2月25日，星期天RNA由核糖核苷酸经磷酯键缩合而成长链状分子核苷酸之间的连结方式：3‘,5’-磷酸二酯键生产5’-复合单核苷酸第22页,共43页，2024年2月25日，星期天1．技术路线固定化酶法生产5’-复合单核苷酸的技术路线

第23页,共43页，2024年2月25日，星期天2．工艺过程(1)5’-磷酸二酯酶的制备(2)固定化5’-磷酸二酯酶的制备

(3)转化反应

(4)5’-复合单核苷酸的分离纯化

(5)精制及灌封第24页,共43页，2024年2月25日，星期天5’-磷酸二酯酶的制备

取干麦芽根，加9～10倍体积(W/V)的水，用2mol/LHCl调pH至5.2，于30℃条件下浸泡15～20h，然后加压去渣，浸出液过滤，滤液冷却至5℃，加入2.5倍体积(V/V)的95％冷工业乙醇(5℃)，于5℃静置2～3h后，吸去上层清液，回收乙醇，下层离心收集沉淀，用少量丙酮及乙醚先后洗涤2～3次，真空干燥，粉碎得5’-磷酸二酯酶。第25页,共43页，2024年2月25日，星期天固定化5’-磷酸二酯酶的制备

取上述磷酸二酯酶0.2kg(控制固定化后的固定化酶比活力在100U/g以上为宜)，用1.5％的(NH4)2SO4溶液溶解，过滤得酶液。另取湿ABXE—纤维素树脂40kg，加入0～5℃的蒸馏水至80L，搅拌下先后加入1mol/LHCl和5％NaNO2溶液各10L，搅拌均匀，于0～5℃下反应150min后，抽滤；第26页,共43页，2024年2月25日，星期天滤饼迅速用预冷的0.05mol/LHCl和蒸馏水各洗3次，抽干后将滤饼投入上述5’-磷酸二酯酶溶液中，搅拌均匀后用1mol/LNa2CO3溶液调pH8.0，搅拌反应30min，用冷水洗3～4次，抽干，得固定化5’-磷酸二酯酶。第27页,共43页，2024年2月25日，星期天转化反应

取2kgRNA，缓慢加入预热至60～70℃的360LpH5.0的10-3mol/LZnCl2溶液中，用1mol/LNaOH溶液调至pH5.0～5.5，滤除沉淀，将清液升温至70℃，加入上述湿的固定化5’-磷酸二酯酶40kg(要求酶的比活在100U/g以上)，于67℃维持pH5.0～5.5，搅拌反应1～2h。第28页,共43页，2024年2月25日，星期天根据增色效应，用紫外吸收法判断转化平衡点。转化完成后，滤出转化液，用于分离5’-单核苷酸。固定化酶再继续用于下一批转化反应。第29页,共43页，2024年2月25日，星期天5’-复合单核苷酸的分离纯化

将上述转化液用6mol/LHCl溶液调pH至3.0，滤除沉淀，滤液用6mol/LNaOH溶液调pH至7.0，进入已处理好的Cl-型阴离子交换树脂柱(Ф30cm×100cm)，流速为2～2.5L/min，吸附后，用250～300L去离子水洗涤柱床;第30页,共43页，2024年2月25日，星期天然后用3％NaCl溶液以l～1.2L/min流速洗脱，当流出液pH达到7.0时开始分部收集，直至洗脱液中不含核苷酸为止，合并含核苷酸钠的洗脱液进行精制。第31页,共43页，2024年2月25日，星期天

精制及灌封

上述核苷酸钠溶液用薄膜浓缩器减压浓缩后，测定核苷酸含量，再用无热原质水稀释至20mg/mL，加入0.5％～1.0％(g/mL)药用活性炭，煮沸10min脱色和除热原，滤除活性炭，滤液经6号除菌漏斗或0.45μm孔径的微孔滤膜过滤除菌后灌封，即为5’-复合单核苷酸注射液。第32页,共43页，2024年2月25日，星期天热原质热原质是在生产过程中由于被污染后由杂菌所产生的一种内毒素。各种杂菌所产生的热原反应有所不同。革兰氏阴性菌产生的热原反应一般比革兰氏阳性菌的为强。

第33页,共43页，2024年2月25日，星期天热原注入体内引起恶寒高热，严重的引起休克。它是多糖磷类脂质和蛋白质的结合体，为大分子有机物质，能溶于水。在280℃加热4h它能被破坏90%；第34页,共43页，2024年2月25日，星期天180~200℃加热半小时或150℃加热2h能被彻底破坏。它亦能被强酸、强碱、氧化剂(如高锰酸酸钾)等破坏。它能通过一般滤器，但能被活性炭、石棉滤材等所吸附。第35页,共43页，2024年2月25日，星期天生产中常用活性炭脱色去除热原，但须注意脱色时pH，温度、炭用量及脱色时间等因素，还应考虑它对抗生素的吸附问题，否则会影响抗生素的产量；第36页,共43页，2024年2月25日，星期天此外，对某些产品可用超微过滤办法去除热原，还应加强在生产过程中的环境卫生以防止热原。第37页,共43页，2024年2月25日，星期天3.固定化酶法生产L-氨基酸目前氨基酸在医药、食品以及工农业生产中的应用越来越广。以适当比例配成的混合液可以直接注射到人体内，用以补充营养。各种必需氨基酸对人体的正常