第四章 发酵工业无菌技术课件

发酵工程FermentationEngineering太原科技大学环境与安全学院徐宏英第四章发酵工业无菌技术第四章发酵工业的无菌技术第四章发酵工业无菌技术本章内容第一节概念第二节发酵工业污染的防治策略第三节发酵工业的无菌技术第四节培养基及设备灭菌第五节空气除菌第四章发酵工业无菌技术一、概念第一节发酵工业的无菌技术灭菌消毒除菌防腐

目前，绝大多数工业发酵都采用纯种培养，要求整个发酵过程无杂菌。为保证纯种发酵，在生产菌种接种之前要对发酵培养基、空气系统、流加料、发酵罐及管道系统等进行灭菌，对环境消毒。发酵工业的无菌技术第四章发酵工业无菌技术灭菌(sterilization):

用化学或物理方法杀死物料或设备中所有有生命物质的过程。

消毒(disinfection):

用物理或化学方法杀死空气、地表以及容器和器具表面的微生物。

除菌(degermation):

用过滤方法除去空气或液体中的微生物及其孢子。

第四章发酵工业无菌技术防腐(antisepsis):

用物理或化学方法杀死或抑制微生物的生长和繁殖。发酵工业无杂菌技术：

一般采用“污染概率”作为评价标准。发酵工业中允许的染菌率是10-3，即灭菌1000批次的发酵中只允许有1次染菌。第四章发酵工业无菌技术二、消毒与灭菌的区别消毒仅仅是杀灭生物体或非生物体表面的微生物，一般只能杀死营养细胞，不能杀死细菌芽孢和真菌孢子，适合于发酵车间的环境和发酵设备、器具的无菌处理；灭菌是杀灭所有的生命体，适合于培养基等物料的无菌处理。第四章发酵工业无菌技术第二节发酵工业污染的防治策略

一、污染的危害二、污染危害的具体分析三、污染的防治第四章发酵工业无菌技术一、污染的危害

杂菌造成培养基营养消耗杂菌合成新产物；或改变了发酵液的某些理化性质，菌体自溶、发粘等造成产物提取分离困难，收率低，质量下降；杂菌的代谢会改变原反应体系的pH，发生异常变化；杂菌分解产物，使生产失败；噬菌体污染后，微生物细胞裂解，生产失败。第四章发酵工业无菌技术染菌率国外：抗生素发酵染菌率为2%~5%。国内：青霉素发酵染菌率为2%；链霉素、红霉素和四环素发酵染菌率为5%；谷氨酸发酵噬菌体的染菌率为1%~2%

。第四章发酵工业无菌技术二、染菌危害的具体分析

1、染菌对不同菌种发酵的影响A．细菌谷氨酸：发酵周期短，培养基不太丰富，较少染杂菌，但噬菌体威胁大，难以防治。肌苷：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染菌，染菌后，营养成分迅速被消耗，严重抑制菌生长和合成代谢产物。发酵菌体不同，培养基、发酵条件、周期及产物性质不同，染菌类型及危害不同。第四章发酵工业无菌技术B.

霉菌PenG：易染菌，杂菌分泌青霉素水解酶，PenG迅速被破坏，发酵一无所获。柠檬酸：产酸后，pH降为2.0，不易染菌，主要防止前期染菌，后期注意酸性菌感染。C.

酵母菌:主要防止细菌以及野生酵母菌污染。

D.

疫苗：要求高，一旦染菌，无论污染的是活菌、死菌或内外毒素，都应全部废弃。第四章发酵工业无菌技术2、染菌种类对发酵的影响青霉素：怕染细短产气杆菌链霉素：怕染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌四环素：怕染双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌柠檬酸：怕染青霉菌肌苷（酸）：怕染芽孢杆菌谷氨酸：怕染噬菌体，易造成连续污染第四章发酵工业无菌技术

种子扩大时期染菌:危害极大，灭菌后弃去。发酵前期染菌：应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分，重新接种。发酵中期染菌：挽救困难，应早发现，尽快处理，处理方法应根据各种发酵的特点和具体情况来决定。3、不同发酵时期染菌对发酵的影响第四章发酵工业无菌技术柠檬酸发酵（分别处理）a.污染细菌：加大通风，加速产酸，调pH3.0以下，抑制细菌生长。b.污染酵母：加入0.025~0.035g/LCuSO4抑制酵母；通风加大，加速产酸。c.染黄曲霉：加入另一罐将近发酵成熟的醪液，

pH下降，黄曲霉自溶。d.染青霉菌：在pH很低下能够生长。提前放罐。

第四章发酵工业无菌技术发酵后期污染染菌量不太多，可继续发酵。污染严重，则提前放罐。杀菌剂的添加：前期无必要，增加成本；发现后加入，效果要具体评价。第四章发酵工业无菌技术4、杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响丝状菌发酵被产酸菌污染：pH不断下降，菌丝大量自溶，发酵液粘度增加，过滤困难。处理方法：①将发酵液加热后再加助滤剂；②先加絮凝剂使蛋白质凝聚后沉淀。杂菌分泌较多蛋白质杂质时，对发酵后处理过程中采用溶媒萃取的提取工艺非常不利，使水相和溶媒之间极易发生乳化，水相和溶剂相难分离，应提前去除。第四章发酵工业无菌技术1、染菌的检查与类型的判断显微镜检查法平板划线培养或斜面培养检查法肉汤培养检查法发酵过程的异常现象判断发酵过程中，如何及早发现杂菌、及时处理是避免染菌造成严重损失的重要手段。要求用准确、迅速的方法检查出染菌类型及可能的染菌途径。第四章发酵工业无菌技术1）显微镜检查法

采用简单染色法或革兰氏染色法，也可进行芽孢和鞭毛染色。此法简单、直接，杂菌污染需要繁殖一定数量才能镜检，检出杂菌需要一定时间。2）平板划线培养或斜面培养检查法

将待检样品在无菌平板上划线，根据可能的污染类别分别于37℃、27℃培养，8h后观察。噬菌体检查可采用双层平板法：噬菌斑12~20h第四章发酵工业无菌技术3）肉汤培养检查法将待检样品接入无菌肉汤培养基，根据可能的污染类别分别于37℃、27℃培养，8h后观察。4）发酵过程的异常现象观察法溶解氧水平异常变化pH异常变化尾气CO2异常变化

发酵液黏度、发酵液颜色及泡沫等异常变化第四章发酵工业无菌技术12溶解氧水平异常变化染噬菌体异常发酵菌体浓度变化第四章发酵工业无菌技术通过传感器或取样分析，发现pH的变化和正常发酵有较大差别，一般有杂菌污染。污染产酸菌或利用碳源效率高生长较快的杂菌，会出现pH下降现象。pH异常变化第四章发酵工业无菌技术对于特定的发酵，工艺一定时，尾气中CO2含量变化是有规律的。染菌后，培养基中糖的消耗速度发生变化，引起尾气中CO2含量的异常变化。染杂菌，耗糖加快，尾气中CO2含量增加；染噬菌体，耗糖减慢，尾气中CO2含量减少。尾气中CO2异常变化第四章发酵工业无菌技术2、污染原因分析

主要原因：

①

种子带菌②无菌空气带菌③设备渗漏④灭菌不彻底

⑤操作失误⑥技术管理不善第四章发酵工业无菌技术从污染时间看：早期污染可能与①②④⑤→接种操作不当有关；后期污染可能与③⑤及中间补料有关。从染菌幅度看：各个发酵罐或多数发酵罐染菌，且所污染的是同一种杂菌，一般是空气系统问题，若个别罐连续染菌，一般是设备问题。第四章发酵工业无菌技术从杂菌种类看：耐热芽孢杆菌：与④有关。球菌、无芽孢杆菌：与①②③⑤有关。浅绿色菌落的杂菌：与水有关，即冷却盘管渗漏。霉菌：与④⑤有关，即无菌室灭菌不彻底或操作问题。酵母菌：糖液灭菌不彻底或放置时间较长。第四章发酵工业无菌技术3、杂菌污染的途径及其预防A、种子带菌的防治

灭菌锅灭菌彻底接种可靠：无菌室、设备及无菌操作可靠保藏可靠无菌室：

1）一般紫外线杀灭；

2）如有较多的细菌，用石碳酸或土霉素杀灭；

3）如有较多的霉菌，用制霉菌素杀灭；

4）如有噬菌体，用甲醛、双氧水或高锰酸钾等杀灭。

第四章发酵工业无菌技术B、过滤空气带菌的防治

从空气的除菌净化流程和设备的设计、过滤介质的选用和填装，以及过滤介质的灭菌和管理等方面完善空气净化系统。1）正确选择采气口提高采气口的位置或安装前置粗过滤器，提高空压机进口空气的洁净度。2）设计合理的空气预处理流程，尽可能减少过滤空气的含油量和湿度，提高温度，保持过滤介质的干燥状态。第四章发酵工业无菌技术3）设计和安装合理的空气过滤器，防止过滤器失效，选用除菌效率高的过滤介质。C、设备的渗漏或“死角”造成的染菌及其防治渗漏染菌1）设备、管道、阀门在使用过程中，由于腐蚀、加工制做不良等原因形成微小漏孔后，发生渗漏而染菌。选用优质材料，并定期进行检查。2）冷却用的夹套内壁或蛇管的微小漏孔不易被发现，可以压入弱碱性水，在罐内可疑地方用浸湿酚酞指示剂的白布擦，有渗漏则白布变红。第四章发酵工业无菌技术“死角”染菌由于操作、设备结构或人为因素造成的屏障等原因，使蒸汽不能到达预定的灭菌部位或该部位的冷空气不易在加热过程中排净，从而不能达到彻底灭菌要求的部位。往往是发酵罐和设备的盲端。第四章发酵工业无菌技术1）发酵罐的“死角”

法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌轴拉杆、联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支撑件。口：入孔（或手孔）、排风管接口、灯孔、视镜口、进料管口。

发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”

消除方法：加强清洗并定期铲除污垢；安装放汽边阀第四章发酵工业无菌技术发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”

第四章发酵工业无菌技术法兰连接不当造成的“死角”第四章发酵工业无菌技术2）管道安装不当或配置不合理形成的“死角”

采用单独的排气、排水和排污管可有效防止染菌的发生。接种、取样、补料和加消泡剂等的管道一般配置单独的灭菌系统。法兰的加工、焊接和安装要符合灭菌要求，使衔接处管道畅通、光滑、密封性好，垫片和法兰内径匹配，安装时对准中心。

第四章发酵工业无菌技术灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方法第四章发酵工业无菌技术D、培养基与设备灭菌不彻底的防治原料性状：大颗粒的原料过筛除去，淀粉质原料、麸皮及黄豆饼搅拌均匀，防止结块，并加入一定量的淀粉酶液化。实罐灭菌时要打开所有的液面下的进气阀和液面上的排气阀及连接管、压力表的边阀，充分排除罐内冷空气，避免罐内的温度和压力表指示不符，彻底灭菌。灭菌过程中产生的泡沫造成染菌：添加消泡剂，防止泡沫升顶。连续灭菌过程中，最好采用自动控制装置，避免蒸汽压力波动过大，温度达不到要求。灭菌后期罐压骤变灭菌不彻底，冷却发酵罐过快，造成罐内负压，而使带菌空气从密封不严处进入。冷却发酵罐前，要通入无菌空气。第四章发酵工业无菌技术E、操作不当造成染菌（操作严格规范）

在放大移种或发酵过程中，罐内压力跌至零，外界空气进入染菌；泡沫顶盖染菌；管道阀门操作不当致使压缩空气的压力突然下降，罐内压力高，发酵液倒流进入液面以下管道及空气滤器而染菌。F、噬菌体染菌及其防治

环境污染导致空气传播的噬菌体染菌。采用抗噬菌体菌种；提高空气洁净度，净化生产环境。第四章发酵工业无菌技术采取哪些措施能够保持无菌发酵？物料、培养基、中间补料要灭菌；发酵设备及辅助设备（空气过滤装置、各种发酵罐进出口连接装置）和管道要灭菌；好气发酵通入的空气要除菌；种子无污染；接种无菌操作过关；为了保持发酵的长期无菌状态，需维持正压。第四章发酵工业无菌技术第三节发酵工业的无菌技术干热灭菌法湿热灭菌法射线灭菌法化学药剂灭菌法过滤除菌法火焰灭菌法第四章发酵工业无菌技术原理：利用电热或红外加热到高温杀死微生物。温度、时间：160~170℃、1~2h。设备：恒温电热干燥箱。优点：灭菌器皿保持干燥。适宜对象：要求保持干燥的器具和材料。如培养皿、移液管等。一、干热灭菌法第四章发酵工业无菌技术原理：利用高温氺蒸汽杀死微生物。温度、时间：121℃、0.5h。设备：高压蒸汽灭菌锅。优点：灭菌彻底。适宜对象：培养基、玻璃器皿、无菌水、缓冲液、金属器具等。二、湿热灭菌法第四章发酵工业无菌技术原理：利用紫外线、高能电磁波、或放射性物质产生的高能粒子杀死微生物。时间：10～50s

。设备：紫外灯、粒子发射仪等。缺点：灭菌不彻底。适宜对象：物体表面、超净台及培养室等环境灭菌。三、射线灭菌法第四章发酵工业无菌技术原理：利用化学药剂与微生物发生反应杀死微生物。药剂：甲醛、漂白粉、高锰酸钾、环氧乙烷及季铵盐（新洁尔灭）缺点：不能对培养基灭菌。适宜对象：发酵工厂环境灭菌。四、化学药剂灭菌法第四章发酵工业无菌技术原理：利用过滤方法阻留微生物以达到除菌的目的。适宜对象：不耐高温的液体培养基组分和空气过滤除菌。五、过滤灭菌法第四章发酵工业无菌技术原理：利用火焰直接杀死微生物以达到除菌的目的。优点：方法简单，灭菌彻底。适宜对象：金属器具（接种针、接种环、接种铲、小刀及镊子）和玻璃器具灭菌。六、火焰灭菌法第四章发酵工业无菌技术第四节发酵培养基及设备管道灭菌

一、湿热灭菌原理

二、分批灭菌（实罐灭菌）三、连续灭菌（连消）四、分批灭菌与连续灭菌的比较五、发酵培养基及设备管道灭菌技术

第四章发酵工业无菌技术1、微生物热阻2、微生物热死定律：对数残留定律3、非对数残留定律4、灭菌温度和时间的选择5、影响培养基灭菌的其它因素一、湿热灭菌原理第四章发酵工业无菌技术1、热阻

定义：微生物对热的抵抗力称为热阻，指微生物在某一特定条件下（主要是温度）的致死时间。相对热阻：某一微生物在某一条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间比。致死温度：杀死微生物的极限温度。致死时间：在致死温度下，杀死全部微生物所需要的时间。一般微生物的营养细胞60℃加热10min全部死亡，芽孢100℃加热数分钟甚至数小时才能被杀死。第四章发酵工业无菌技术2.对数残留定律

在一定温度下，微生物受热致死遵循分子反应速度理论，微生物受热死亡的速率-dN/dt与任何瞬间残留的活菌数N成正比，即

式中：

N:残留活菌数，个；N0:开始灭菌时的活菌数，个；

Nt:经过t时间灭菌后的活菌数，个；t：受热时间，min；

k：比死亡速率常数（灭菌速率常数），min-1

DN/dt:活菌数瞬时变化速率，及死亡速率。第四章发酵工业无菌技术计算灭菌的基本公式：灭菌时间取决于：污染程度（N0）灭菌程度（Nt）残留菌数

k值由上式可知：当Nt=0时，t=∞，既无意义，也不可能。一般采用Nt=0.001，即1000次灭菌中只有一次失败。第四章发酵工业无菌技术判断微生物受热死亡难易程度的基本依据。不同微生物在相同温度下的k值是不同的，k值愈小，则此微生物愈耐热，热阻愈大。（k↓，热阻↑,灭菌t↑）比死亡速率k将存活率Nt/N0对时间t在半对数坐标上作图，可以得到一条直线，其斜率的绝对值即比死亡速率

k。第四章发酵工业无菌技术大肠杆菌在不同温度下的残留曲线第四章发酵工业无菌技术3、非对数残留定律

杂实际过程中，某些微生物受热死亡的速率不符合对数残留定律，如一些微生物芽孢。

将存活率Nt/N0对时间t在半对数坐标上作图，可以得到残留曲线，而不是一条直线。呈现这种热死亡非对数动力学行为的主要是芽孢，可以最具代表性的“菌体循序死亡模型”来描述。第四章发酵工业无菌技术嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢在不同温度下的死亡曲线

第四章发酵工业无菌技术

kRksNRNsNDdNR/dt=-kRNRdNs/dt=kRNR-ksNs→Nt/N0=KR/(kR-kS)[ekst-ks/kRe-kRt]

式中NR：耐热性活芽孢数；Ns：敏感性活芽孢数

ND：死亡的芽孢数；kR：耐热性芽孢的比死亡速率；

ks：敏感性芽孢的比死亡速率；

N0：初始活芽孢数。菌体循序死亡模型第四章发酵工业无菌技术培养基中含有大量的不耐热的微生物和相当数量的耐热性微生物时的灭菌残留曲线

。

在温度T相同时，对数与非对数定律的灭菌时间t则不同。第四章发酵工业无菌技术4、灭菌温度和时间的选择

微生物的受热死亡属于单分子反应，其灭菌速率常数k与温度之间的关系可用阿累尼乌斯方程表示：

k=Aexp(-△E/RT)

式中：A为阿累尼乌斯常数，s-1；

k为灭菌速度常数；

T为热力学温度，K；

R为气体常数，8.314J/(mol●K)；△E为微生物死亡活化能，J/mol。第四章发酵工业无菌技术灭菌过程中培养物质受热破坏也可看作一级反应：式中C：对热不稳定物质的浓度，mol/L；

t：分解反应时间,s；k’：分解速度常数,s-1。k’的变化也遵循阿累尼乌斯方程：

都与相应的活化能及T有关第四章发酵工业无菌技术

当温度从T1→T2㏑(k2/k1)/㏑(k2’/k1’)=ΔE/ΔE’>1(∵ΔE>ΔE’即杀死微生物的活化能大于成分分解活化能)

∴随着T上升，菌死亡速率增加倍数大于培养基成分分解速率增加倍数，故一般选择高温快速灭菌。第四章发酵工业无菌技术5.影响培养基灭菌的其它因素

1）培养基成分油脂、糖类及一定浓度的蛋白质、高浓度有机物等可以增加微生物的耐热性；低浓度（1%-2%）NaCl对微生物有保护作用，随着浓度增加，保护作用减弱，当浓度达8%-10%以上，则减弱微生物的耐热性。第四章发酵工业无菌技术2）pH：

pH6.0-8.0，微生物最耐热，pH<6.0，H+易渗入微生物细胞内，改变细胞的生理反应促使其死亡。∴培养基pH愈低，灭菌所需时间愈短。3）培养基的物理状态

固体培养基的灭菌时间比液体的（对流作用）要长。相同温度下，固体培养基的灭菌时间比液体培养基的灭菌时间要长2~3倍。第四章发酵工业无菌技术4）泡沫泡沫中的空气形成隔热层，对灭菌极为不利，可加入少量消泡剂。5）培养基中的微生物数量

培养基中微生物的数量与灭菌时间呈正比。天然基质培养基、营养丰富或变质的原料中含菌较多。第四章发酵工业无菌技术二、分批灭菌（实罐灭菌）定义：分批灭菌就是将配制好的培养基放入发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起进行灭菌的操作过程，也称为实罐灭菌。优点：不需要专门的灭菌设备，投资少，设备简单，灭菌效果可靠，对蒸汽的要求较低。第四章发酵工业无菌技术用空气过滤器灭菌并用空气吹干夹套或蛇管排冷水，开启排气管阀，空气管通蒸汽，也可夹套内通蒸汽达70℃左右取样管放料管通蒸汽120℃，1×105pa保温保温阶段，凡液面以下各管道都应通蒸汽，液面上其余各管道则应排蒸汽，不留死角，维持压力、温度恒定罐压接近空气压力向罐内通无菌空气保温结束，依次关闭各排汽、进汽阀门夹套或蛇管中通冷水培养基降温到所需温度

1.灭菌工艺过程第四章发酵工业无菌技术分批灭菌包括升温、保温和冷却三个阶段。升温、冷却两阶段也有一定的灭菌效果，考虑到灭菌的可靠性主要在保温阶段进行，故可以简单地利用式

㏑(Nt/N0)=-kt

来粗略估算灭菌所需时间。2.灭菌时间的估算第四章发酵工业无菌技术例1：有一发酵罐内装40m3培养基，在1210C温度下实罐灭菌，原污染程度为每1ml有2×105个耐热细菌芽孢，已知1210C时灭菌速度常数k=1.8min-1，求灭菌失败机率为0.001时所需时间。

解：N0=40×106×2×105=8×1012(个)Nt=0.001(个)k=1.8(min-1)

㏑(Nt/N0)=-kt

t=2.303/k[lg(N0/Nt)]=2.303/1.8[lg(8×1015)]=20.34(min)由于升温阶段就有部分菌被杀灭，特别是当培养基加热至1000C以上，这个作用较为显著，实际保温阶段时间比计算值要短。

第四章发酵工业无菌技术三、连续灭菌（连消）定义：连续灭菌就是将配制耗的培养基向发酵罐等培养装置输送的同时进行加热、保温和冷却等灭菌操作过程。优点：可以在比分批灭菌更高的温度下灭菌，保温时间很短，减少营养物的破坏，提高发酵产率。注意：连续灭菌前要进行空罐灭菌，加热器、维持罐及冷却器也应先进行灭菌。第四章发酵工业无菌技术1、工艺流程喷淋冷却连续灭菌流程喷射加热连续灭菌流程薄板式换热器连续灭菌流程2、灭菌时间的计算

㏑(Ct/C0)=－ktt=2.303/k[lg(C0/Ct)]

式中：C0、Ct分别为单位体积培养基灭菌前、后的含菌数。第四章发酵工业无菌技术例2．某发酵罐内装40m3培养基，采用连续灭菌，灭菌温度为1310C，原污染程度为每1ml含有2×105个杂菌，已知1310C时灭菌速度常数为15min-1，求灭菌所需的维持时间。连续灭菌时间的估算解：C0=2×105(个/ml)Ct=0.001/(40×106)=2.5×10-11(个/ml)t=2.303/k[lg(C0/Ct)]=2.303/15×lg[(2×105)/(2.5×10-11)]=2.37min第四章发酵工业无菌技术喷淋冷却连续灭菌流程维持8~25min预加热110~130℃第四章发酵工业无菌技术维持管子长度保证保温时间急速升温急速冷却冷却段加热段第四章发酵工业无菌技术四、分批灭菌与连续灭菌的比较

连续灭菌的优点：（适用于大型罐）可采用高温短时灭菌，营养成分破坏少，有利于提高发酵产率；发酵罐利用率高；蒸汽负荷均衡；采用板式换热器时，可节约大量能量；适宜采用自动控制，劳动强度小；可实现将耐热性物料和不耐热性物料在不同温度下分开灭菌，减少营养成分的破坏。第四章发酵工业无菌技术缺点：对小型罐无优势，不方便，对设备要求高；蒸汽波动时灭菌不彻底；当培养基中含有固体颗粒或有较多泡沫时，以分批灭菌好，防止灭菌不彻底。

第四章发酵工业无菌技术五、发酵培养基及设备管道灭菌技术1、种子罐、发酵罐、计量罐、补料罐等的空罐灭菌及管道灭菌2、空气总过滤器和分过滤器灭菌3、种子培养基实罐灭菌4、发酵培养基实罐灭菌5、发酵培养基连续灭菌6、补料实罐灭菌第四章发酵工业无菌技术1、种子罐、发酵罐、计量罐、补料罐等的

空罐灭菌及管道灭菌从有关管道通入蒸汽，使罐内蒸汽压力达0.147MPa，维持45min。灭菌过程中，液位以上的阀门和边阀门打开排气，灭菌完毕后关闭，待罐内压力低于空气过滤器压力时，通入无菌空气保压0.098MPa。第四章发酵工业无菌技术2、空气总过滤器和分过滤器灭菌排出过滤器中的空气，从过滤器上部通入蒸汽，并从上下排气口排蒸汽，维持压力0.147MPa

灭菌2h。灭菌完毕，通入压缩空气吹干。第四章发酵工业无菌技术3、种子培养基实罐灭菌从夹层通入蒸汽间接加热至80℃

，再从取样管、进风管、接种管等液面以下的阀门通入蒸汽，进行直接加热。同时，关闭夹层蒸汽进口阀门，升温至121℃

，维持30min。期间，所有液面以上的阀门保持一定时间的排蒸汽状态。第四章发酵工业无菌技术4、发酵培养基实罐灭菌从夹层或盘管式热交换器通入蒸汽，间接加热至90℃

，关闭夹层或盘管蒸汽；从取样管、进风管、放料管等液面以下的阀门通入蒸汽，直接加热至121℃

，维持30min；期间，所有液面以上的阀门保持一定时间的排蒸汽状态。第四章发酵工业无菌技术5、发酵培养基连续灭菌一般培养基的连续灭菌采用灭菌温度为130℃

，维持5min。根据料液不同而异，淀粉料液为121℃

，维持5~10min。尿素溶液灭菌为105℃

，维持5min。6、补料实罐灭菌第四章发酵工业无菌技术第五节空气除菌

一、概述二、空气过滤除菌流程三、空气预处理四、空气预处理流程设计应用举例五、空气过滤介质六、空气过滤除菌原理七、提高过滤除菌效率的措施第四章发酵工业无菌技术一、概述空气除菌的必要性

以一个50m3的发酵罐为例，若装料系数为0.7，要求每立方米发酵液每分钟通气0.8m3，培养周期170h，那么每个周期需通气量2.86×105m3(50×0.7×0.8×170×60)，而每立方米大气中约有103-104个微生物。

空气带菌是发酵染菌的主要原因之一。第四章发酵工业无菌技术空气除菌方法辐射杀菌：超声波、高能阴极射线，x射线、β射线、γ射线、紫外线(2265Å~3287Å)加热杀菌：加热方法可用蒸汽、电和空气压缩机产生的热量静电除菌：常用于洁净工作台、洁净工作室所需无菌无尘空气的第一次除尘，配合高效过滤器使用。过滤除菌：采用定期灭菌的介质来阻截流过的空气所含的微生物而取得无菌空气。常用的过滤介质有棉花、活性炭、玻璃纤维、有机合成纤维、有机和无机烧结材料等等。第四章发酵工业无菌技术第四章发酵工业无菌技术二、空气过滤除菌流程空气过滤除菌：

采用定期灭菌的介质来阻截流过的空气中所含微生物而制得无菌压缩空气。过滤介质：

棉花、活性炭、玻璃纤维、有机合成纤维、有机或无机烧结材料等。第四章发酵工业无菌技术流程主要设备：空气压缩机、空气过滤器

附属设备：粗过滤器、气液分离器、空气贮罐、空气冷却器第四章发酵工业无菌技术空气过滤除菌的一般流程：前置空气过滤器进行粗滤空压机升压一级冷凝器对压缩空气降温二级甚至多级冷凝器降温除水、除油空气加热器降低湿度空气储罐稳压空气过滤器除菌无菌空气进入发酵罐。1、对空气过滤除菌流程的要求第四章发酵工业无菌技术流程的制定应根据所在地的地理、气候环境和设备条件综合考虑环境污染比较严重的地方，要考虑改变吸风的条件（升高10米，大气中的微生物下降一个数量级）；在温暖潮湿的南方，要加强除水设施；压缩机耗油严重的设备流程中则要加强消除油雾的污染，也可采用无油润滑的往复式压缩机；往复式压缩机，要配备前置粗过滤器及空气贮罐。通常要求压缩空气的相对湿度Φ=50%~60%时通过过滤器为好。第四章发酵工业无菌技术2、空气除菌流程的分析空气除菌系统包括：冷却、分离油水、加热、过滤几种典型的设备流程两级冷却、加热除菌流程冷热空气直接混合式空气除菌流程高效前置过滤空气除菌流程将空气冷却至露点以上的流程利用热空气加热冷空气流程一次冷却和析水的空气过滤流程第四章发酵工业无菌技术

两级冷却、加热除菌流程图1-粗过滤器；2-空压机；3-贮罐；4，6-冷却器；5-旋风分离器；7-丝网分离器；8-加热器；9-过滤器30~35℃20~25℃100%50~60%第四章发酵工业无菌技术

冷热空气直接混合式空气除菌流程图

1-粗过滤器；2-压缩机；3-贮罐；

4-冷却器；5-丝网分离器；6-过滤器冷热空气直接混合第四章发酵工业无菌技术

利用热空气加热冷空气的流程示意图1-高空采风；2-粗过滤器；3-压缩机；4-热交换器；5-冷却器；6，7-析水器；8-空气总过滤器；9-空气分过滤器第四章发酵工业无菌技术

将空气冷却至露点以上的流程1－高空采风；2－粗过滤器；3－压缩机；4－冷却器；5－冷却器；6－空气总过滤器；7－空气分过滤器第四章发酵工业无菌技术

高效前置过滤空气除菌流程图1—高效前置过滤器；2—压缩机；3—贮罐；4—冷却器；5—丝网分离器；6—加热器；7—过滤器第四章发酵工业无菌技术

一次冷却和析水的空气过滤流程示意图1－高空采风；2－粗过滤器；3－压缩机；4－冷却器；5，6—析水器；7—贮罐；8—加热器；9—空气总过滤器；10—空气分过滤器第四章发酵工业无菌技术三、空气预处理原理：除尘(外源空气的前处理)：防塞，提高过滤效率和滤器寿命；措施：建吸风塔、粗过滤器、高效前置过滤器降温：防烧伤介质及水分蒸发严重，对发酵不利除油、除水：防塞（因油膜堵），防止过滤器长菌堵塞（因水滴）加热：保持相对湿度稳压：防止压力波动，贮罐第四章发酵工业无菌技术目的：提高空气压缩前的洁净度，减小压缩机的磨损和主过滤器的负荷。措施：1）建吸风塔，提高空气吸气口的位置；

2）设置粗过滤器，滤去大尘埃和菌类。粗过滤器：

布袋过滤器、填料过滤器、油浴洗涤和水雾除尘装置等。1、外源空气的前过程第四章发酵工业无菌技术2、空气压缩和压缩空气的冷却

1）目的：为了克服输送过程中过滤介质等的阻力。2）设备：

涡轮式空压机、往复式空压机

空气净压缩后，温度会显著升高，压缩比愈高，温度也愈高。第四章发酵工业无菌技术空气压缩后温度的计算：空气的压缩过程可看作绝热过程，故压缩后的空气温度与被压缩的程度有关：

T2=T1(P2/P1)(k-1)/k

式中T1,T2——压缩前后空气的绝对温度，KP1,P2——

压缩前后空气的绝对压强，Pak——绝热指数，空气为1.4

若压缩为多变过程，则可用多变指数m（对于空气m=1.2-1.3）代替绝热指数k。第四章发酵工业无菌技术例3：20oC的大气被压缩至表压2.5kg/cm2时温度是多少？解：T1=20+273=293kP2/P1=（2.5+1.033）/1.033=3.42m=1.3T2=T1(P2/P1)(m-1)/m=293×3.420.3/1.3=389k∴t2=389-273=116oC第四章发酵工业无菌技术高温压缩空气需要冷却降温防止引起过滤介质的碳化或燃烧；防止引起菌种损伤；减小发酵罐降温负荷。第四章发酵工业无菌技术3、压缩空气冷却后的除水、除油经冷却降温的压缩空气相对湿度增大，会析出水来，使过滤介质受潮失效。采用含油空压机压缩空气时，会不可避免地夹带润滑油。

需要除水、除油。第四章发酵工业无菌技术1）几个与湿空气相关的概念空气的绝对湿度：1m3

湿空气中含有的水蒸气绝对量(kg)空气的相对湿度（Φ）：空气的绝对湿度与同温度下饱和绝对湿度之比值或者空气中水蒸汽分压与同温度时的饱和水蒸汽压之比值，称为空气的相对湿度。

Φ=Pw/Ps

式中

Pw——空气中水蒸气分压，

Pa

Ps——同温度下水的饱和蒸气压，Pa，

它可由各类手册中查到。空气的湿含量（X）：1kg干空气中含有的水汽量

（kg/kg干空气）第四章发酵工业无菌技术1）几个与湿空气相关的概念A、空气的绝对湿度：

1m3

湿空气中含有的水蒸气绝对量(kg)。B、空气的相对湿度（Φ）：

空气的绝对湿度与同温度下饱和绝对湿度之比值或空气中水蒸汽分压与同温度时的饱和水蒸汽压之比称为空气的相对湿度。

Φ=Pw/Ps

式中：Pw——空气中水蒸气分压，Pa；

Ps——同温度下水的饱和蒸气压，Pa；可由各类手册中查到。第四章发酵工业无菌技术C、空气的湿含量（X）空气的湿含量是指1kg干空气中含有的水汽量。

设Ggkg干空气中含Gwkg水蒸汽时，则

X=Gw/Gg

又Pw/Pg=nw/ng=(Gw/Mw)/(Gg/Mg)=(Gw/Gg)·(Mg/Mw)

（Mw，Mg分别为水和空气的分子量）∴X=Gw/Gg=(PwMw)/(PgMg)=(18/28.94)·(Pw/Pg)X=0.622Pw/Pg

X=0.622Pw/(P-Pw)

（4-1）第四章发酵工业无菌技术2）Φ与X的关系

将ΦPs=Pw代入式4-1中得

X=0.622ΦPs/（P-ΦPs）所以，已知某一温度T时Φ值，便可求得X。①当X一定时，T1→T2，导致Φ1→Φ2，则X1=0.622Φ1Ps1/(P1-Φ1Ps1)X2=0.622Φ2Ps2/(P2-Φ2Ps2)∵X1=X2∴Φ2=Φ1(PS1/PS2)(P2/P1)

（式4-2）第四章发酵工业无菌技术②当X发生变化，即有水析出时，X降低，此时Φ2=100%，

定义：当Ф=1时，空气中水蒸气已饱和，此时温度称为露点Td。当T<Td时，有水析出，X↓。当ΔX=0时，压缩过程中，随着T↑，Ps↑，P↑，Ф↓；降温过程中，随着T↓，Ps↓，P一定，Ф↑。第四章发酵工业无菌技术压缩空气冷却到一定温度，除去油水后，空气的相对湿度会达到100%。温度稍一下降，还会析出水来。还需加热，以降低空气的相对湿度，达到50~60%。空压机出来的空气是脉冲式的，安装空气储罐可消除，维持罐亚稳定，还可使剩余液滴沉降除去。3）空气的再加热和稳定

第四章发酵工业无菌技术预处理流程设计的简繁关键：去湿问题四、空气预处理流程设计第四章发酵工业无菌技术思考题压缩空气的露点比原始空气的露点更高