酶及细胞固定化

酶及细胞固定化什么是固定化酶？水溶性酶水不溶性载体水不溶性酶（固定化酶）固定化技术第2页,共69页，2024年2月25日，星期天随着固定化技术的发展，作为固定化的对象不一定是酶，也可以是微生物细胞、植物细胞、动物细胞或细胞器。此外，固定化生物催化剂的研究还发展到多酶体系的固定化，以及带有ATP、NAD(P)这一类辅酶的复合酶反应系的固定化。第3页,共69页，2024年2月25日，星期天第一节概述一、固定化酶的优缺点优点：多次使用可以装塔连续反应纯化简单提高产物质量应用范围广缺点：首次投入成本高大分子底物较困难第4页,共69页，2024年2月25日，星期天二、固定化的原则酶催化作用依靠它的高级结构及活性中心，固定化时活性中心的必需基团应避免参加反应；避免高温、强碱、有机溶剂以及高浓度盐的处理，保护靠氢键、离子键、疏水键等弱键维系的酶蛋白质的高级结构。尽可能在温和条件下进行固定化反应。

第5页,共69页，2024年2月25日，星期天三、固定化酶的性质及其影响因素(一)影响固定化酶性质的因素1．酶本身的变化，主要是由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生了变化。2．载体的影响（1）分配效应（2）空间障碍效应（3）扩散限制效应3.固定化方法的影响第6页,共69页，2024年2月25日，星期天(二)固定化后酶性质的变化1.酶活性下降：(1)酶活性中心的重要氨基酸与水不溶性载体相结合；(2)当酶与不溶性载体相结合时，它的结构起了变化；(3)酶被结合后虽不失活，但酶与底物的相互作用受到空间位阻。

前二种可用适当条件加以克服，而第三中则无法克服了。至于包埋法固定化酶的活性下降，可能是因为固定化过程中酶有些变化或者底物和产物对凝胶的渗透力较小之故。第7页,共69页，2024年2月25日，星期天2．对酶稳定性的影响操作稳定性提高贮存稳定性比游离酶大多数提高。对热稳定性，大多数升高，有些反而降低。对分解酶的稳定性提高。对变性剂的耐受力升高原因:固定化后酶分子与载体多点连接。酶活力的释放是缓慢的。抑制自降解，提高了酶稳定性。第8页,共69页，2024年2月25日，星期天3．固定化酶pH的变化载体带负电荷，pH向碱性方向移动；载体带正电荷，pH向酸性方向移动。产物性质对pH的影响催化反应的产物为酸性时，固定化酶的pH值比游离酶的pH值高；反之则低第9页,共69页，2024年2月25日，星期天4．最适温度变化一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化。5．

底物特异性变化作用于低分子底物的酶特异性没有明显变化既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶特异性往往会变化。第10页,共69页，2024年2月25日，星期天6．米氏常数Km随载体性质变化由于分配效应：ρ=[Si]微环境/[S]宏观环境

Km'=Km/ρ(表观米氏常数)（1）载体与底物带相同电荷，Si]<[S],ρ<1,Km’>Km固定化酶降低了酶的亲和力。（2）载体与底物电荷相反，静电作用，[Si]>[S]，则ρ>1,Km'<Km对简单的固定化酶系统，其动力学性质一般服从米氏方程：第11页,共69页，2024年2月25日，星期天四、评价固定化酶的指标1．酶活定义（IU)：在特定条件下，每分钟催化一微摩尔底物转化为产物的酶量定义为1个酶活单位。

——计量单位酶比活定义（游离）：每毫克酶蛋白或酶RNA（DNA)所具有的酶活力单位

——品质的体现第12页,共69页，2024年2月25日，星期天1.固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的酶活力单位。或：单位面积（cm2）的酶活力单位表示（酶膜、酶管、酶板）。2.操作半衰期：衡量稳定性的指标。连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需要的时间（t1/2）3.4.或称偶联效率，活力保留百分数。5.相对酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶活力第13页,共69页，2024年2月25日，星期天五、固定化酶的活力测定方法1.振荡测定法：称取一定量的固定化酶加入一定量的底物溶液，一边振荡或搅拌，一边进行催化反应取出一定量的反应液进行酶活力测定。2.酶柱测定法：将一定量的固定化酶装进具有恒温装置的反应柱中让底物溶液以一定的流速流过酶柱收集流出的反应液测定其中产物的生成量或底物的消耗量。3.连续测定法：利用连续分光光度法等测定方法可以对固定化酶反应液进行连续测定，从而测定固定化酶的酶活力。

第14页,共69页，2024年2月25日，星期天第二节固定化酶的制备（一）吸附法（二）结合法（三）交联法（四）包埋法（entrappingmethod）第15页,共69页，2024年2月25日，星期天第16页,共69页，2024年2月25日，星期天（一）吸附法---物理吸附法（1）常用载体无机物有机物高分子化合物活性炭、白陶土、氧化铝、多孔玻璃、硅胶、碳酸钙凝胶淀粉麸质、大孔树脂、DEAE纤维素、DEAE葡聚糖凝胶（2）固定化酶的制备机理所用载体具有活性，可将酶吸附到载体上。（3）优缺点

优点：酶蛋白活性中心不易被破坏，完整保持酶的高级结构;方法简单，成本低。缺点：酶吸附不牢固，易脱落；防止吸附酶的蛋白质与载体发生变性反应第17页,共69页，2024年2月25日，星期天（一）吸附法---离子键结合法酶与具有离子交换基团的不溶性载体结合形成固定化酶（1）所用载体纤维素的衍生物，离子交换树脂（2）固定化酶的制备机理酶蛋白的带电基团和含有离子交换基团的固相载体之间由于静电相吸而形成络合物，使酶吸附到离子交换剂上。（3）优缺点优点：操作简便，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心不易破坏，有利于制备高活性酶缺点：载体与酶的结合力较弱，在高离子强度下酶易从载体上脱落第18页,共69页，2024年2月25日，星期天(二)共价键结合法

酶与不溶于水的载体以共价键形式结合制备固定化酶的方法。即，通过化学共价键，把与酶蛋白活性无关的氨基酸功能基团连接在不溶于水的载体上。1.酶与载体反应的主要功能基团游离羟基：肽链C－末端的α–羧基、天门冬酰氨酸、谷氨酸的β－γ羧基游离氨基：肽链N－末端的δ－氨基、赖氨酸ε－氨基巯基：半胱氨酸羟基：丝氨酸、苏氨酸酚基：酪氨酸咪唑基：组氨酸第19页,共69页，2024年2月25日，星期天2.载体活化的方法A．重氮法B．叠氮法C．烷基化反应法D．硅烷化法E．溴化氰法第20页,共69页，2024年2月25日，星期天A．重氮法反应示意式如下：

亚硝酸重氮化与酪蛋白反应第21页,共69页，2024年2月25日，星期天A．重氮法目前在我们国内用的较多的载体是对氨基苯磺酰乙基（ABSE）纤维素、琼脂糖，葡聚糖凝胶和琼脂等该方法需要载体具有芳香族氨基反应式及原理：第22页,共69页，2024年2月25日，星期天A．重氮法例5′-磷酸二酯酶的固定化此酶用来降解核酸，可分离得到四个5′-单核苷酸；对-β-硫酸酯乙砜基胺（SESA）作为双功能试剂，将酶共价结合到多糖载体上；本成果荣获国家发明三等奖，中国科学院上海生化研究所袁中一等，我国第一个用于工业生产的固定化酶）

第23页,共69页，2024年2月25日，星期天B叠氮法例：用羧甲基纤维素叠氮衍生物制备固定化葡萄糖淀粉酶步骤如下：⑴酯化：CM-纤维素先洗涤干燥，然后悬于无水甲醇中，在冰浴中通入HCl气体，进行酯化反应；然后洗涤，空气干燥。⑵肼解。把酯化后的CM-纤维素悬于甲醇中，再加入80%水合肼回流反应1小时，过滤，洗涤干燥。⑶叠氮化。肼解后的CM-纤维素（1g）加入150ml2%HCl在冰浴中混合，搅拌滴加9ml3%NaNO2反应20min，过滤用冷蒸馏水洗涤，同时加酶。(4)偶联：经叠氮化后的载体加入0.05NpH8.0磷酸缓冲液（内含250-500mg酶），5℃搅拌2-3小时，过滤，用0.001NHCl，水洗涤，即为固定化葡萄糖淀粉酶（冻干保存）。第24页,共69页，2024年2月25日，星期天将与载体反应的功能基团与各种重氮化剂、烷化剂等反应形成共价键制备固定化酶。 纤维素+盐酸甲醇CMC－甲酯＋肼CMC－酰肼CMC－叠氮化物＋NH2酶亚硫酸钠盐酸＋固定化酶－CH2CO-NH酶CMC－CH2COOH制备酰肼叠氮化物羧甲基纤维素叠氮法制备固定化葡萄糖淀粉酶程序纤维素羧甲基化羧甲基纤维素第25页,共69页，2024年2月25日，星期天C．烷基化反应法第26页,共69页，2024年2月25日，星期天D．硅烷化法一般常用的载体：多孔玻璃，多孔陶瓷。多孔玻璃特点：①机械强度好，表面积大。②耐有机溶剂和微生物破坏。载体可以再生，寿命长等。

第27页,共69页，2024年2月25日，星期天E．溴化氰法本方法主要用溴化氰（CNBr）活化多糖类物质。如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等。第28页,共69页，2024年2月25日，星期天（三）交联法制备固定化酶概念：双功能试剂或多功能试剂与酶蛋白质中的氨基酸残基作用，使酶与酶之间交联成网，凝集成固定化酶1、发生作用的氨基酸残基：酪氨酸的酚基胱氨酸的SH巯基

N－末端的a－氨基。2、常用的双功能或多功能试剂：戊二醛聚甲叉双碘乙酰胺双重氮联苯胺第29页,共69页，2024年2月25日，星期天先将酶吸附在不溶于水的载体上，再用双功能试剂戊二醛与酶蛋白的氨基之间交联起来，形成酶网包围在载体表面。

常用载体：硅胶、离子交换树脂。第30页,共69页，2024年2月25日，星期天（四）包埋法制备固定化酶酶本身不参与反应，仅用物理方法把酶包埋在凝胶细小的格子中，或包围在半透膜或聚合物中。包埋方法有两种：1格子型固定化酶2微型胶囊法（1）原理以丙烯酰胺、硅胶、淀粉琼脂等材料，在酶存在下聚合成凝胶，酶被包埋在聚合物的细小多孔的网状格子中。反应为厌氧反应。第31页,共69页，2024年2月25日，星期天酶液丙烯酰胺N，N－双丙烯酰胺氢气催化剂：四甲基乙二胺、明矾胺引聚剂：过硫酸钾、核黄素光照聚合反应凝胶酶块固定化酶切割（2）方法（以丙烯酰胺为材料是最常用的方法）第32页,共69页，2024年2月25日，星期天第33页,共69页，2024年2月25日，星期天2微型胶囊法（1）原理

把酶包在超薄半透性的聚合物膜中，制成球状含酶微型胶囊。（2）特点微囊直径几微米～几百微米。低分子底物可以自由通过并进入微囊内。与酶反应后的生成物被排除在微囊外，酶本身是高分子物质不能通过微囊而被留在微囊中，外部的蛋白分解酶、抗体等高分子物质也无法进入微囊内第34页,共69页，2024年2月25日，星期天以亲水性单体和疏水性单体在表面发生聚合反应将酶包围起来，形成微型胶囊酶。分三步：常用形成胶囊的材料和生成的聚合物种类：亲水性单体疏水性单体生成的聚合物聚胺聚异氰衍生物聚胺、聚酯乙二醇、多元醇聚异氰衍生物聚胺、聚酯3.表面聚合法制备微型胶囊第35页,共69页，2024年2月25日，星期天A乳化分散：取含有酶和亲水性单体的水溶液，在不溶于水的有机溶媒中充分乳化。B表面聚合：将含有疏水性单体的有机溶媒加入到上述乳化液中，发生聚合反应，生成的薄膜把酶包围起来形成微型胶囊球。三步：C清洗：反应完成后，用有机溶剂洗去未反应的剩余单体1表面聚合法第36页,共69页，2024年2月25日，星期天各类固定化方法的特点比较:

比较项目吸附法结合法交联法包埋法物理吸附.共价键结合离子键结合制备难易易难易较难较难固定化程度弱强中等强强活力回收率较高低高中等高载体再生可能不可能可能不可能不可能费用低高低中等低底物专一性不变可变不变可变不变适用性酶源多较广广泛较广小分子底物、药用酶第37页,共69页，2024年2月25日，星期天第三节

固定化细胞固定化菌体概念：把菌体细胞中特定的酶不经过分离提纯，直接用适当的方法将菌体加以固定来催化各种特定的生物化学反应。优点：不需提制酶，可保持酶的活性。反复使用，成本低——与固定化酶比较制备方法：与固定化酶相同，有包埋法、载体结合法、交联法、热处理法、射线处理法。其中包埋法是最理想的方法。第38页,共69页，2024年2月25日，星期天一包埋法1原理在菌体细胞本身不发生化学反应的情况下，将其包进半透性的多聚物膜内。小分子的底物和产物均可自由出入，而菌体细胞却不会漏出。2方法常用的包埋材料是：聚丙烯酰胺凝胶、明胶、琼脂以制备含天门冬氨酸的大肠杆菌细胞为例将菌体细胞预先用生理盐水悬浮，向悬浮液中加入聚丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺，然后加入催化剂过硫酸胺和加速剂四甲基乙二胺，混匀后放置一定时间聚合。将得到的凝胶破碎即得到固定化细胞。收率达72.5％第39页,共69页，2024年2月25日，星期天二载体结合法（吸附法）1原理微生物细胞表面带有电荷，在适当的条件下可以与载体的离子交换基团形成络合物或吸附在载体上。2常用载体离子交换纤维素。阴离子树脂、DEAE－纤维素。3优缺点优点：方法简单、载体易于再生。缺点：结合力弱，菌体细胞易脱落。第40页,共69页，2024年2月25日，星期天研究热点——光交联树脂包埋法

例：相对分子量为1000-3000的光交联聚氨酯预聚物等，加入1%左右的光敏剂，加水配成一定浓度，加热至50℃，然后与一定浓度的细胞悬浮液混合均匀，摊成一定厚度的薄层，用紫外照射3min，就可制得第41页,共69页，2024年2月25日，星期天第四节固定化原生质体和辅酶一、原生质体固定化的方法制备原生质体——将原生质体重新悬浮在含有渗透压稳定剂的缓冲液中配成原生质体悬浮液——包埋法固定化原生质体。关键：原生质体如何制备？第42页,共69页，2024年2月25日，星期天二、原生质体的制备将对数生长期的细胞收集——悬浮在含有渗透压稳定剂的高渗缓冲液中——去细胞壁——分离纯化——得到原生质体-活性鉴定第43页,共69页，2024年2月25日，星期天三、酶解注意要点1、酶解前要预处理：主要是为了使酶渗透到细胞器中去。采取的策略：先加入物质抑制或阻止某种细胞壁的成分合成，可以使酶插入。一般加入：巯基乙醇，Triton-100,甘氨酸、青霉素。2、酶系选择：溶菌酶、蜗牛酶、β葡聚糖酶、纤维素、半纤维素和果胶酶3、酶浓度选择（0.5%-1%）4、酶解温度和pH5、酶解终点确定第44页,共69页，2024年2月25日，星期天四、稳定剂（高渗溶液）要求1.加入的化合物对细胞和原生质体无毒性2.不会影响水解酶的活性3.对代谢产物无不良影响四、稳定剂加入操作注意点1.一定pH（酶和菌体活性最高）2.一定的浓度（过高浓度原生质体易脱水皱缩）3.种类：无机盐-对细菌有机物糖和糖醇-酵母4.易于渗入质膜、易于被原生质体和菌体分解的物质不宜作为稳定剂第45页,共69页，2024年2月25日，星期天五、原生质体细胞活性的检测1荧光素双醋酸盐（FDA)染色法2酚藏花红染色法3伊文思兰染色法第46页,共69页，2024年2月25日，星期天六、辅酶固定化1、原因有机辅因子中具有某些特殊的化学基团，参与酶的催化反应(递氢、递电子或递某些化学基团的作用）有机辅因子在使用过程中要流失，并且不能自行再生有机辅因子价格昂贵——工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留和再生第47页,共69页，2024年2月25日，星期天辅酶固定化的方法：2、固定化方法与酶相似，一般采用溴化氰法，碳二亚胺法以及重氮偶联法等共价偶联，或将其进行适当的化学修饰后固定在超滤器中。3、辅酶固定化必须解决辅酶在多个酶之间传递的障碍。策略：先在辅酶的一定部位进行修饰--引入功能团和间隔臂（形成辅酶衍生物）--再与水溶性高分子结合第48页,共69页，2024年2月25日，星期天辅酶的固定化第49页,共69页，2024年2月25日，星期天辅酶的固定化第50页,共69页，2024年2月25日，星期天辅酶再生的形式：辅酶和酶共固定 与酶分子偶联成辅酶-酶复合物第51页,共69页，2024年2月25日，星期天第四节固定化技术的应用●生产果葡糖浆●生产6-APA和抗生素●生产乙醇和啤酒●生产氨基酸●生产苹果酸●生产淀粉酶第52页,共69页，2024年2月25日，星期天生产果葡糖浆利用葡糖异构酶是胞内酶的特性，可以直接将含酶的菌体细胞固定化，进行果葡糖浆(也称高果糖浆)的工业生产。与以前采用水溶状态的葡糖异构酶或含有此酶的微生物菌体的分批法相比，固定化生物催化剂连续生产法具有以下优点：①果葡糖浆质量均一；②随着异构效率的提高，甜度也增强；③可以得到色浅、混浊度小的透明糖液；④可以制得灰分少、纯度高、风味佳的产品等。有关的固定化方法很多，曾报道过的有加热固定法、离子吸附法、絮凝法、包埋法、交联法等。例如加热法，将含葡糖异构酶的白色链霉菌的菌体细胞，在60～65℃加热处理10min，酶就固定在细胞内。此法简便，成本低廉，工业上容易采用。

第53页,共69页，2024年2月25日，星期天生产6-APA和抗生素6-APA即6-氨基青霉烷酸，是半合成青霉素的重要原料。利用含青霉素酰胺酶的固定化细胞，可生产6-APA。例如，中国科学院微生物研究所和太原制药厂曾研究采用各种不同的方法制备含青霉素酰胺酶的固定化细胞。

抗生素是一大类重要的发酵产品，近年来在研究利用固定化菌体生产青霉素和杆菌肽方面也有所突破，引起了人们的注意。尤其是利用固定化细胞可以由单一营养物生成杆菌肽，这是比传统发酵法(用淀粉-肉汤培养基)优越的地方。第54页,共69页，2024年2月25日，星期天生产乙醇和啤酒(一)生产酒精酒精发酵需要大型发酵罐，不但设备繁杂，操作困难，而且耗费一部分糖以供酵母生长之用。自从应用固定化细胞进行连续发酵日益发展后，酒精发酵时间由传统方法的36h缩短至3h以下，乙醇生产能力每小时为20～50g/L，而传统方法仅为2g/L。例如，千田一郎等将酵母固定于K-角叉菜胶，利用这种固定化增殖酵母可稳定、连续生产一年以上，并且生产速率比以前的发酵法快10多倍。另外，关于细菌固定化的研究也颇为活跃，据Arcuri等报道，将运动发酵单胞菌用玻璃纤维吸附，使用由葡糖5-20%及酵母膏0.5%配成的培养基，连续发酵28d，乙醇生产能力152g/L·h(停留时间为10～15min)，这要比固定化酵母的乙醇生产能力大得多。第55页,共69页，2024年2月25日，星期天(二)生产啤酒利用麦芽汁发酵生产啤酒，实际上是一种特殊类型的酒精发酵。近年来，利用固定化酵母细胞生产啤酒的研究已经很多。例如，white等人报道了一个利用海藻酸钙凝胶包埋非絮凝性细胞，连续生产啤酒的方法。Linko等人将酵母细胞固定于海藻酸钙凝胶内，置于填充式柱式反应器内，用于由麦芽汁连续发酵生产啤酒，可维持几个月，其麦芽汁在柱式反应器内的停留时间为2h，啤酒的酒精含量可达到4.5%。我国上海工业微生物所从1979年起，也开始进行了固定化酵母细胞连续发酵啤酒的研究。

第56页,共69页，2024年2月25日，星期天生产氨基酸(一)生产L-天门冬氨酸L-天门冬氨酸作为医药品、食品添加剂和甜味肽原料而被大量使用。目前用于生产L-天门冬氨酸的菌种都是大肠杆菌，固定化的方法以凝胶包埋法的效果较好。例如，千田一郎利用角叉菜聚糖凝胶包埋大肠杆菌，L-天门冬氨酸酶的活力比聚丙烯酰胺凝胺包埋法制得的固定化大肠杆菌的酶活力大大提高，而且用戊二醛、六甲叉二胺处理后，稳定性明显增加，其生产能力较聚丙烯酰胺包埋法的提高15倍。(二)生产L-丙氨酸例如，Yamamoto等利用K-角叉菜聚糖固定含L-天门冬氨酸-β-脱羧酶的德阿昆哈假单胞菌，装入柱式反应器，由L-天门冬氨酸连续生产L-丙氨酸。

第57页,共69页，2024年2月25日，星期天生产苹果酸生产L-苹果酸自1972年起，千田一郎等人利用聚丙烯酰胺凝胶包埋含有延胡索酸酶的产氨短杆菌，制成固定化细胞，实现了L-苹果酸的连续、高效、大量、廉价的工业化生产。

第58页,共69页，2024年2月25日，星期天生产淀粉酶利用聚丙烯酰胺凝胶包埋的枯草杆菌合成α-淀粉酶，是固定化菌研究方面又一新进展。通过扫描式电子显微镜检查得知，凝胶中的细菌在保温过程中仍在生长，所以Kokubu等人认为，利用固定化菌体柱，在不久的将来进行α-淀粉酶的工业生产是有可能的。可见，固定化技术在工业上显示出广阔的应用前景。第59页,共69页，2024年2月25日，星期天在实际应用中需要考虑的一些重要因素主要有：(1)用于固定化的载体和试剂的成本；(2)固定化后酶的活力与回收率；(3)操作过程中固定化酶和固定化细胞的稳定性；(4)在长时间使用后，固定化酶或固定化细胞的再生能力。目前，固定化增殖细胞方面的研究进展很快。可以预期，在不久的将来有可能利用固定化微生物生产氨基酸、多肽、核苷酸、辅酶、乙醇、啤酒、抗生素、酶制剂、有机酸、激素等产品，这将使整个发酵工业和化学工业发生根本性的变革。第60页,共69页，2024年2月25日，星期天固定化酶、固定化细胞反应器第61页,