第34章 DNA的复制和修复课件

第34章DNA的复制和修复

（DNAReplicationandRepair）内

容

DNA的复制DNA的损伤和修复DNA的突变第34章DNA的复制和修复

DNA是生物遗传的主要物质基础，生物机体的遗传信息以密码的形式编码在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序，并通过DNA的复制由亲代传递给子代。1953年Watson&Crick提出DNA双螺旋结构模型后，1958年，Crick提出了“中心法则”(Centraldogma)揭示了遗传信息的传递规律。蛋白质逆转录翻译转录复制复制DNARNA第34章DNA的复制和修复第一节DNA的复制

DNA的复制：是指以原来DNA分子为模板合成出相同分子的过程。一、DNA的半保留复制

DNA在复制时，两条链解开分别作为模板，在DNA聚合酶的催化下按碱基互补的原则合成两条与模板链互补的新链，以组成新的DNA分子。这样新形成的两个DNA分子与亲代DNA分子的碱基顺序完全一样。由于子代DNA分子中一条链来自亲代，另一条链是新合成的，这种复制方式称为半保留复制(semiconservativereplication)。第34章DNA的复制和修复ParentalStrandsStrandduplication1/2old1/2newStrandseparation第34章DNA的复制和修复半保留复制的实验证明

1958年Meselson和Stahl的实验首次有力地支持了半保留复制方式。实验步骤：１.大肠杆菌放在15NH4C1培养基中生长12代。２.再将细菌移到只含有14NH4C1的培养基中培养。３.裂解细胞。４.将裂解液放在CsC1溶液中进行密度梯度离心。５.在紫外光下可以看到形成的区带。

第34章DNA的复制和修复第34章DNA的复制和修复二、DNA复制的起点和方式复制子:DNA复制从起点开始直到终点为止，每一个这样的DNA单位称为复制子或复制单元(replicon)。复制起点:DNA复制在生物细胞中要从DNA分子上特定位置开始。这个特定的位置就称为复制起点(Originofreplication)，用ori表示。复制叉:DNA复制的生长点形状如同分叉故称为复制叉(replicationfork)。第34章DNA的复制和修复原核生物的染色体和质粒，真核生物的细胞器DNA都是环状双链分子。实验表明，它们都在一个固定的起点开始复制，复制叉移动方向大多是双向的，即形成两个复制叉或生长点，分别向两侧进行复制；也有的是单向的，只形成一个复制叉或生长点DNA的双向和单向复制复制叉起始点起始点起始点复制叉复制叉未复制DNA单向复制双向复制环状

DNA复制时所形成的q结构起始点复制叉的推进第34章DNA的复制和修复

用遗传学和生物化学的方法可以确定大肠杆菌染色体DNA的复制起点在基因图谱上的位置。起点oriCilvthr0/180Lacattl255075malAcysCtryAhistrpTre终点大肠杆菌复制起点和终点在基因图谱上的位置83min33min第34章DNA的复制和修复EvidencepointstobidirectionalreplicationLabelatbothreplicationforks第34章DNA的复制和修复DNA复制的不同方式

A.直线双向

B.多起点双向

C.θ型双向

D.θ型单向

E.滚动环

F.Ｄ环

A.直线双向第34章DNA的复制和修复三、DNA聚合反应有关的酶酶反应式：

n1dATPDNApolEdAMPn2dGTP+DNAdGMPn3dCTPMg2+dCMPn4dTTPdTMP

DNA1．DNA的聚合反应和聚合酶

1956年，Kornberg在大肠杆菌提取液中发现DNA聚合酶，以后陆续在不同生物中找到。+(n1+n2+n3+n4)PPi第34章DNA的复制和修复DNA聚合酶催化的链延长反应3´5´5´3´3´5´5´3´第34章DNA的复制和修复由DNA聚合酶催化的DNA合成反应ABCD

模板-引物产物第34章DNA的复制和修复DNA聚合酶的反应特点：以四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)为底物;反应需要模板的指导;反应需要有引物3‘-OH存在;DNA链的生长方向是5'→3'产物DNA的性质与模板相同。

第34章DNA的复制和修复2.大肠杆菌DNA聚合酶大肠杆菌共有5种不同的DNA聚合酶：DNA聚合酶Ⅰ，II，III，IV，V。第34章DNA的复制和修复DNA聚合酶Ⅰ(DNApolymeraseⅠ,DNApolⅠ)理化性质：纯化的DNApolⅠ由一条多肽链组成，多肽链中含有一个锌原子。酶分子空间结构近似球体。DNApolⅠ约含1000个氨基酸残基，MW为103kD。经蛋白酶处理后，酶分子分裂成两个片段：大片段（Klenow片段）有聚合酶和3'→5'外切酶活性，小片段有5'→3'外切酶活性。5'→3'外切酶活性3'→5'外切酶活性聚合酶NCKlenow片段(MW68kD)小片段(MW35kD)蛋白酶第34章DNA的复制和修复第34章DNA的复制和修复功能：聚合功能:

通过核苷酸聚合反应使DNA链沿5'→3'方向延长。在引物DNA或RNA-OH末端，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令由DNApolⅠ逐个将核苷酸加上去，就是DNApolⅠ的聚合作用。酶的专一性主要表现为新进入的脱氧核苷酸必须与模板DNA配对时才有催化作用。第34章DNA的复制和修复

3'→5'外切酶活性──校对作用:

这种酶活性的主要功能是从3'→5'方向识别和切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸（对单链作用）。第34章DNA的复制和修复5'→3'外切酶活性就是从5'→3'方向水解DNA生长链前方的DNA链，主要产生5'-脱氧核苷酸。这种酶活性只对DNA上配对部分(双链)磷酸二酯键有切割活力作用，方向是5'→3'。每次能切除10个核苷酸。这种酶活性在DNA损伤的修复中可能起着重要作用（切除由紫外线照射而形成的嘧啶二聚体）。对冈崎片段5'末端RNA引物的去除依赖此种外切酶活性。5'→3'外切酶活性──切除修复作用:第34章DNA的复制和修复焦磷酸解作用:DNApolⅠ的这种活性可以催化3'末端焦磷酸解DNA分子。焦磷酸交换作用:催化dNTP末端的PPi同无机焦磷酸的交换反应。这两种作用，都要求有较高浓度的PPi，因此，在体内由于没有足够高的PPi而无重要意义。第34章DNA的复制和修复

DNA聚合酶Ⅱ（DNApolII)DNA聚合酶Ⅰ缺陷的突变株仍能生存，这表明DNApolⅠ不是DNA复制的主要聚合酶。1970年发现了DNApolⅡ。此酶为多亚基，MW88KD，每个细胞内约有100个酶分子。第34章DNA的复制和修复催化特性：5‘→3’聚合酶活力:该酶催化DNA的聚合，但是对模板有特殊的要求。该酶的最适模板是双链DNA而中间有缺口(gap)的单链DNA部份，而且该单链空隙部份不长于100个核苷酸。3'→5'外切酶活性，但无5'→3'外切酶活性。该酶不是复制的主要聚合酶，因为此酶缺陷的大肠杆菌突变株的DNA复制都正常。第34章DNA的复制和修复DNA聚合酶Ⅲ组成

：DNApolⅢ全酶是由多种亚基组成的蛋白质，而且容易分解。现在认为它是大肠杆菌细胞内真正负责重新合成DNA的复制酶。第34章DNA的复制和修复组建作用DNA-dependentATPase第34章DNA的复制和修复功能A．聚合:以模板作指导，以四种脱氧核糖核苷酸作为底物，并且需要有3'

－ＯＨ的引物链存在，通过核苷酸聚合反应使DNA链沿5’→3’方向延长。催化脱氧核苷酸掺入DNA链的速率分别是DNA聚合酶Ⅱ和I的15倍和30倍。B．3'→5'外切酶活性第34章DNA的复制和修复大肠杆菌三种DNA聚合酶比较DNA聚合酶Ⅱ分子量每个细胞的分子统计数5´-3´聚合酶作用3´-5´核酸外切酶作用5´-3´核酸外切酶作用合成速度（核苷酸/分）持续合成能力DNA聚合酶Ⅰ103,000400+++1,000-1,2003-20088,000100++-2,4001,500830,00010-20++-15,000-60,000≥500,000比较项目DNA聚合酶III切除引物修复修复复制功能第34章DNA的复制和修复聚合酶IV和V:

1999年发现,它们涉及DNA的错误倾向修复

(errorpronerepair）第34章DNA的复制和修复DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的。它是一种封闭DNA链上切口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5‘-PO4与另一DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键。这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外)，而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。

DNA连接酶的主要功能就是在DNA聚合酶Ⅰ催化聚合，填满双链DNA上的单链间隙后封闭DNA双链上的切口。这在DNA复制、修复和重组中起着重要的作用。3.DNA连接酶(DNAligase)第34章DNA的复制和修复连接酶连接切口Mg2+连接酶ATP或NAD＋AMP+PPi或NMN+AMPATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPPOHTGGATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPTGGP切口3'3'5'5'5'5'3'3'模板链模板链第34章DNA的复制和修复DNA的一条链的复制是半不连续的四、DNA的半不连续复制冈崎片段：

1968年，冈崎等用3H－脱氧胸苷标记T4噬菌体感染的大肠杆菌，然后通过碱性密度梯度离心法分离标记的DNA产物，发现短时间内首先合成的是较短的DNA片段，接着出现较大的分子。最初出现的DNA片段长度约为1000个核苷酸左右，称为冈崎片段（Okzakifragment）。第34章DNA的复制和修复复制叉的移动方向解旋酶DNA聚合酶III解链酶RNA引物引物体DNA聚合酶ISSB3´3´5´前导链滞后链3´5´复制的起始DNA链的延长DNA链终止5´RNA引物3´3´第34章DNA的复制和修复RNA引物的合成：

以DNA为模板，NTP为原料，在引物合成酶催化下，合成10-几十个核苷酸。

这是保证DNA聚合过程高度精确的又一措施。已知DNA聚合酶具有35外切酶功能校对复制过程中的核苷酸，也就是说聚合酶在开始形成一个新的磷酸二酯键前，总是检查前一个碱基是否正确，它不能从头开始合成。因此先合成一条低忠实性的多核苷酸来开始DNA的合成，并以核糖核苷酸来表示是“暂时”的，当DNA聚合以后再将其切除，以高忠实性的脱氧核苷酸取而代之，确保复制的忠实性。第34章DNA的复制和修复

核酸的拓扑结构是指核酸分子的空间结构。两条互相缠绕的双螺旋核酸分子表现出许多拓扑学的关系。在DNA的复制、重组、转录和组装等过程中无不牵涉到其拓扑结构的转变。拓扑异构酶（topoisomerase)：DNA在复制过程中双链需要解开。能引起DNA拓扑异构反应的酶为拓扑异构酶。DNA拓扑酶催化同一DNA分子不同超螺旋状态之间的转变。五、复制中的拓扑学问题第34章DNA的复制和修复DNA拓扑异构酶有两类：类型Ⅰ的酶——拓扑异构酶Ⅰ，能使DNA的一条链发生断裂和再连接，反应无需供给能量，可减少负超螺旋。类型Ⅱ的酶——拓扑异构酶Ⅱ（旋转酶），能使DNA的两条链同时发生断裂和再连接，当它引入超螺旋时需要由ATP供给能量，可引入负超螺旋，它们协同作用控制着DNA的负超螺旋水平。

第34章DNA的复制和修复

原核细胞拓扑构酶Ⅰ的作用机制：酶与DNA结合使双链解旋;使一条链切开，但酶与切口的两端结合阻止了螺旋的旋转;酶使另一条链经过切口，然后再将两断端连接起来;酶从DNA上脱落，两条链复原，得到的DNA比原来少一个负性超螺旋。拓扑构酶II的作用机制：该酶能暂时性地切断和重新连接双链DNA，引入负超螺旋，可以消除复制叉前进时带来的扭曲张力，从而促进双链的解开。

第34章DNA的复制和修复真核生物拓扑构酶拓扑构酶I：消除正、负超螺旋类型I

拓扑构酶III：消除负超螺旋

拓扑构酶IIa：消除正、负超螺旋，不能引类型II

拓扑构酶IIb：消除正、负超螺旋入负超螺旋不能引入负超螺旋第34章DNA的复制和修复大肠杆菌旋转酶（gyrase)又称为拓扑构酶II，反应需ATP提供能量，可连续引入负超螺旋，可消除复制叉前进时产生的扭曲张力。第34章DNA的复制和修复将DNA两条链解开，有赖于DNA解螺旋酶，这类酶通过水解ATP获得能量来解开双链，分解ATP的活力要有单链DNA的存在。如双链DNA中有单链末端或缺口，解螺旋酶即可结合于单链部分，然后向双链方向移动。大肠杆菌解螺旋酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ可以沿模板链的5‘→3’方向随着复制叉的前进而移动，而rep蛋白则在另一条模板链上沿3‘→5’方向移动。这两种解螺旋酶的配合作用推动着DNA双链的解开。单链结合蛋白(SSBsingle-strandbindingprotein)：稳定DNA解开的单链，可阻止复性和保护解开的单链不被核酸酶降解。DNA解螺旋酶(DnaB)第34章DNA的复制和修复六、DNA复制的过程分三个阶段：起始延伸终止大肠杆菌复制起点成串排列的重复序列GATCTNTTNTTT成串排列的三个13bp序列共有序列共有序列TTATCCACA

DnaA蛋白结合位点四个9bp序列1.复制的起始第34章DNA的复制和修复DnaB(解螺旋酶)SSBDnaA大肠杆菌DNA复制起点在起始阶段的结构模型（20-40）起始复合物第34章DNA的复制和修复大肠杆菌结合在复制起点的蛋白质第34章DNA的复制和修复DNA复制的调节DNA复制的调节的调节在起始阶段，一旦开始就一直到完DNA复制的起始与DNA的甲基化和细菌脂膜的相互作用有关oriC位点的回文序列GATC（11个）的甲基化新合成链的甲基化滞后13min第34章DNA的复制和修复Areplisomeconsistsof:DNAgyrase,theprimingcomplex(primosome,helicase,primase,primer),SSB,andDNApolymeraseIIIholoenzyme

2.复制的延伸第34章DNA的复制和修复聚合酶III核心酶聚合酶I聚合酶III核心酶滞后链前导链解螺旋酶引物合成酶(DnaG)RNA引物引发体拓扑异构酶II-夹子-聚体-夹子-复合物RNA引物单链结合蛋白（SSB）第34章DNA的复制和修复3.复制的终止oriC复制叉2复制叉1终止复制叉2终止复制叉1复制叉1复制叉2完成复制DNA拓扑异构酶IV连锁染色体修复复制22bpTusTus——terminusutilizationsubstance第34章DNA的复制和修复七、真核生物DNA的复制复制起点：称作自体复制顺序（autonomouslyreplicatingsequence,ARS）或复制基因（replicator）。酵母ARS约有150个bp，含有几个保守序列，这表明在真核生物DNA中有多个复制的起点。真核生物DNA的复制的起始还需要一个原点识别复合物（ORC），受控制真核生物细胞周期的蛋白质的调控。1.多个起点复制第34章DNA的复制和修复起点起点起点起点起点起点

冈崎片段：100-200个核甘酸第34章DNA的复制和修复2.存在复制叉

真核生物DNA复制过程中也出现复制叉，而复制叉的移动速度较原核生物慢，仅为原核生物的1/20，（约50nt/秒）。3.DNA聚合酶

真核生物DNA聚合酶有：a、b、g、d、eDNA聚合酶α：负责染色体DNA的复制。该酶大亚基负责聚合，小亚基负责引物的合成，由于缺乏3’→5’的外切活性，可能参与滞后链RNA引物的合成。

DNA聚合酶δ：负责DNA链的延伸，完成复制。该酶需要增殖细胞核抗原（PCNA）来协助，第34章DNA的复制和修复

其主要功能类似于原核生物DNA聚合酶的β亚基，形成一个环形的夹子，增加DNA聚合酶δ复制的连续性。

DNA聚合酶β：主要负责核DNA的修复。

DNA聚合酶ε：参与冈崎片段的修补。

DNA聚合酶γ：负责线粒体DNA的复制。

第34章DNA的复制和修复哺乳动物的DNA聚合酶DNA聚合酶

(M)亚基数细胞内分布外切酶活性引物合成酶活性持续合成能力抑制剂功能DNA聚合酶

(I)4个细胞核无有中等蚜肠霉素引物合成2个线粒体3

-5

外切酶无高双脱氧TTP线粒体DNA合成2个细胞核3

-5

外切酶无有PCNA时高蚜肠霉素核DNA合成DNA聚合酶

(III)DNA聚合酶

(IV)1个细胞核无无低双脱氧TTP修复DNA聚合酶e(II)＞1个细胞核3

-5

外切酶无高蚜肠霉素修复第34章DNA的复制和修复细菌和真核生物复制体的组成

组成细菌真核生物复制酶DNA聚合酶III全酶DNA聚合酶a/d

进行性因子b夹子PCNA

定位因子g复合物RFC

引物合成酶DnaGDNA聚合酶a去除引物DNA聚合酶I和RNaseHRNaseH1和MF（5

3

外切酶）滞后链修复DNA聚合酶I和DNA连接酶DNA聚合酶e和DNA连接酶I解螺旋酶DnaB

T抗原消除拓扑张力旋转酶

拓扑异构酶II抗原单链结合SSBRP－A第34章DNA的复制和修复八、端粒酶（telomerase）DNA复制时，由于受DNA聚合酶特性限制，子代DNA链的最后一个引物去除引物后，无法填补空隙，易造成子代DNA链的缩短。第34章DNA的复制和修复这一难题是通过端粒（telomere)和端粒酶(telomerase)的发现才得到了澄清。真核线性DNA的末端形成一种特殊的结构并与蛋白质结合成端粒,有许多成串的重复序列，一条链富含G，另一条链富含C，如人的端粒为：TTAGGG。端粒酶是一种含RNA的蛋白复合物，实质上是一种逆转录酶，它能催化互补于RNA模板的DNA片段的合成，使复制以后的线形DNA分子的末端保持不变。第34章DNA的复制和修复5´3´AAAACCCCAAAACCCCCCA端粒酶

初步研究表明，人体中生殖细胞的端粒长度保持不变，而体细胞的端粒长度则随个体的老化而逐步缩短。对此的一个推论是：人的生殖细胞具端粒酶的活力，体细胞则否。这一问题的解决无疑会有助于对生命衰老的认识。第34章DNA的复制和修复第二节DNA的损伤与修复

DNA复制过程中可能发生错配，DNA的重组，病毒基因的整合，常常会破坏局部DNA的双螺旋结构。某些物理化学因子，如紫外线、电离辐射和化学诱变剂等，都能作用于DNA,造成结构的破坏，引起生物突变，甚至致死的作用，称为DNA的损伤。细胞对DNA损伤的修复主要有以下5种类型:错配修复(mismatchrepair)直接修复(directrepair)切除修复(excisionrepair)重组修复(recombinationrepair)易错修复(error-pronerepair)第34章DNA的复制和修复

一、错配修复

错配修复依赖模板链提供的信息。因此，生物体必须有一个区分模板链和新合成链的机制，细胞往往采用甲基化的方式来为模板链加上标签。甲基化位置在GATC序列的A上。第34章DNA的复制和修复Mut基因产物参与错配修复5’3’ExoVIIorRecJExoVIIorRecJ第34章DNA的复制和修复1、形成嘧啶二聚体2、光复活酶结合于损伤部位3、酶被可见光激活4、修复后酶被释放二、直接修复第34章DNA的复制和修复三、切除修复碱基缺陷或错配结构缺陷切开核酸内切酶核酸外切酶切除DNA聚合酶DNA连接酶AP核酸内切酶切开切除修复连接N-糖苷酶(UvrABC)第34章DNA的复制和修复四、重组修复重组复制修复第34章DNA的复制和修复五、应急反应（SOS）和易错修复

许多造成DNA损伤或抑制修复的处理均能引起一系列复杂的诱导反应，称为应急反应（SOSresponse)。SOS反应包括：

DNA损伤或抑制修复诱变效应细胞分裂抑制及溶源性细菌释放噬菌体等第34章DNA的复制和修复SOS诱导的修复反应包括：避免错误的修复（errorfreerepair)易错修复(error-pronerepair)第34章DNA的复制和修复六、与DNA修复有关的人类遗传疾病着色性干皮病

是一种隐性遗传性疾病，有些呈性联遗传。因核酸内切酶（与切除修复有关的酶）异常造成DNA修复障碍所致。临床以光暴露部位色素增加和角化及癌变为特征。幼年发病，常有家族发病史。多数患者于20岁前因恶性肿瘤而死亡。第34章DNA的复制和修复第34章DNA的复制和修复2.遗传性大肠癌、结肠癌的临床特征错配修复相关基因的改变:MSH2,MSH6,PMS1，MLH1,MSH3,PMS2.

第34章DNA的复制和修复3.与重组修复相关基因的改变

Brca1、Brca2的缺陷

80%几率患乳腺癌第34章DNA的复制和修复

第三节DNA的突变

DNA分子中的核苷酸序列发生突然而稳定的改变，从而导致DNA的复制以及后来的转录和翻译产物随之发生变化，表现出异常的遗传特性，称为DNA的突变。它包括由于DNA损伤和错配得不到修复而引起的突变，以及由于不同DNA分子之间的交换而引起的遗传重组。一、突变的类型碱基对的置换(substitution)移码突变(frameshiftmutation)第34章DNA的复制和修复碱基替换：一个碱基对被另一碱基对替换。包括:转换(transtion)嘧啶间或嘌呤间；颠换(transversion)嘧啶嘌呤或嘌呤嘧啶间。移码突变：增加或减少一个或几个碱基对，从而使编码区该位点后的三联体密码子阅读框架改变，导致后向氨基酸都发生