酶工程第七酶的非水相催化

酶工程第七酶的非水相催化非水酶学诞生的生产背景80年代是油脂，香料行业迅猛发展时期，需要许多催化反应生产酯类产物第2页,共60页，2024年2月25日，星期天非水相酶学的诞生水是酶促反应最常用的反应介质。但对于大多数有机化合物来说，水并不是一种适宜的溶剂。因为许多有机化合物(底物)在水介质中难溶或不溶。但对于大多数有机化合物来说，水并不是一种适宜的溶剂。因为许多有机化合物(底物)在水介质中难溶或不溶。由于水的存在，往往有利于如水解、消旋化、聚合和分解等副反应的发生；同时水也使酯化反应的反应平衡不能指定移动。但对于大多数有机化合物来说，水并不是一种适宜的溶剂。因为许多有机化合物(底物)在水介质中难溶或不溶。第3页,共60页，2024年2月25日，星期天是否存在非水介质能保证酶催化？？1984年，克利巴诺夫（Klibanov）等人在有机介质中进行了酶催化反应的研究，他们成功地在利用酶有机介质中的催化作用，获得酯类、肽类、手性醇等多种有机化合物，明确指出酶可以在水与有机溶剂的互溶体系中进行催化反应。早期实验证明酶不能在丙酮乙醇等有机溶剂中催化第4页,共60页，2024年2月25日，星期天非水相酶催化的优点脂溶性底物和产物在有机溶剂中的溶解性较高，有利于提高底物和产物浓度的水平；在适当的条件下，可以使酶促反应的热力学平衡向合成方向(而不是水解方向)移动；同时由于有机溶剂的存在，含水量减少，大大降低了许多水参与的副反应；在非水相中酶的稳定性得到显著提高。如猪胰脂肪酶在99%的有机溶剂中100°C保温数十个小时仍保持较高的酶活性。而在此温度条件下，酶在水溶液中却迅速失活；由于酶不溶于有机溶剂中，酶的重复利用更加方便；可以省略产物的萃取分离过程，提高了产物得率；在有机溶剂存在的条件下，一般不存在微生物对反应体系的污染问题。第5页,共60页，2024年2月25日，星期天非水相酶催化的缺点-酶催化活力下降但与酶在水相中催化时的活性相比，酶在有机溶剂中催化时的活性大大降低。如下因素常被认为与酶在非水相中催化活性降低有关1）在制备酶干粉进行冷冻干燥时酶活性中心构象会发生变化或与有机溶剂直接接触导致的酶活性构象改变；2）pH变化，尤其对于交联体晶体酶而言。同时在冷冻干燥过程中使用挥发性缓冲液也可能导致酶最适pH的改变。第6页,共60页，2024年2月25日，星期天3）酶在有机溶剂中的构象过于刚硬(rigid)导致活性降低；第7页,共60页，2024年2月25日，星期天4）由于酶在有机溶剂中不能溶解，可能存在底物和产物的扩散限制第8页,共60页，2024年2月25日，星期天5）底物在不同溶剂中去溶剂化能(desolvationenergy)的差异；第9页,共60页，2024年2月25日，星期天第一节酶非水相催化的反应介质

有机介质气相介质超临界介质离子液体氟溶剂第10页,共60页，2024年2月25日，星期天酶非水相催化的反应介质—有机溶剂是目前研究最多的一种非水反应介质应用较多的一种反应介质但也是最受诟病的一种反应介质，其毒性，易燃，易爆，容易挥发（碳排放）都引发了其它非水相介质的研究第11页,共60页，2024年2月25日，星期天酶非水相催化的反应介质-气相优点：避免了有机溶剂的使用；酶的回收较为方便；气相中底物和产物的传质效果较好。缺点:反应器中的反应物浓度受到底物蒸汽压的影响酸与醇的酯化反应中酶还受到酸蒸汽的不可逆抑制失活作用

第12页,共60页，2024年2月25日，星期天酶非水相催化的反应介质—超临界流体优点:超临界流体有极好的扩散性和很低的黏度，有利于底物向酶分子扩散。底物在超临界中的溶解度还可通过调节超临界流体的压力和温度来改变。由于通常用于酶催化反应的超临界流体为二氧化碳，它在常温下是气态不会与产物混合，所以可制得高纯度的产物。缺点:设备复杂，难于连续生产和进行工业放大。反应介质还会降低酶表面的pH值且还可能对酶表面进行化学修饰反应结束后取出产物的减压过程也容易造成酶的失活。

第13页,共60页，2024年2月25日，星期天酶非水相催化的反应介质--氟溶剂

高氟代烃通常具有极大的惰性、非极性、热力学稳定、无毒，和一般的有机溶剂、水不能混溶。具有高氟化基团的化合物会优先溶解于含氟溶剂中*如Goto等人发现一些脂肪酶在全氟辛烷(perfluorooctane)中催化反应的速率超出酶在异辛烷中催化反应的速率10倍之多。

第14页,共60页，2024年2月25日，星期天酶非水相催化的反应介质—离子液体(一)离子液体的结构及分类

离子液体是呈现为液态的盐离子液体是完全由阴阳离子组成且常温下呈液态的离子化合物，这些离子化合物结构上存在离子结构对称性低、分子间作用力弱等特点，导致了离子液体熔点接近室温或低于室温，使离子液体成为一种以液态方式存在的盐。

第15页,共60页，2024年2月25日，星期天(二)离子液体的优点

（1）离子液体具有热稳定性高、蒸汽压低和对环境友好等特点而被研究者称为“绿色”的溶剂A室温离子液体没有显著的蒸汽压。虽然在室温离子液体中，阴阳离子间的库仑力较弱，但和一般分子溶剂的分子间的作用力相比，离子液体显然要大得多，因此即使在较高的温度下，离子液体也不易挥发，故离子液体可用于高真空体系，而且对环境无污染，有望为绿色工业开辟新的道路。B离子液体有较好的热稳定性、化学稳定性，可以不必考虑其它溶剂通常具有的易燃性，大大提高了实验室和工业应用中的安全性和可操作性。第16页,共60页，2024年2月25日，星期天（2）离子液体强极性的特点也拓宽了酶催化反应介质选择的范围，这是因为强极性底物一般用强极性溶剂来溶解，但强极性有机溶剂常常使酶失活，而在相同强极性的离子液体中，酶却表现出较好的活性和稳定性*离子液体强极性的特点使它对精细化工和医用产品起始材料的“构建单元”(如肽、糖、核酸等极性底物)具有的较强的溶解性，预示着离子液体可能在精细化工和医用产品生产上扮演重要角色。（3）同时还有很多研究者认为离子液体是一种“可设计”的溶剂，可以通过合成手段合成一系列结构和性质迥异的离子液体来满足各方面研究和应用的需求。第17页,共60页，2024年2月25日，星期天从理论上来讲，这种室温呈溶解状态的盐(moltensalt)按阴阳离子不同排列组合方式有1018种之多，数量十分庞大，但根据阳离子母体的不同可将常见的离子液体大致归纳为四类：分别是咪唑盐类(A)；吡啶盐类(B)；季铵盐类；(C)和季鏻盐类；(D)其阳离子的结构:可作为离子液体的阴离子有：BF4-、PF6-、TA-(CF3COO-)、HB-(C3F7COO-)、TfO-(CF3SO3-)、NfO-(C4F9SO3-)、Tf2N-((CF3SO2)2N-)、Beti-((C2F5SO2-)2N-)、Tf3C-((CF3SO2-)3C-)、SbF6-、AsF6-、NO2-等。第18页,共60页，2024年2月25日，星期天(三)离子液体缺点离子液体也有一些缺点妨碍着它的应用。已合成的离子液体大多黏度很高，这势必给底物和产物的传质带来困难。Kragl等人发现尽管β-糖苷酶在80°C高温下在离子液体1-甲基-3-甲基咪唑甲基璜酸盐(1-methyl-3-methylimidazoliummethanesulfonate,[MMIM][CH3SO3])中仍具有很高的稳定性，但80°C的高温仍然没有解决离子液体粘度较大带来的传质困难。尽管有些离子液体成本可达到70欧元/kg，但价格仍然是限制其应用的重要因素。因此离子液体能否能完全回收利用是其能否工业化应用的重要条件。

第19页,共60页，2024年2月25日，星期天一单相反应体系1微水反应体系酶悬浮态存在（传递问题）一般为疏水有机溶剂，疏水底物溶解性强微量水分维持活性（5%)2与水混溶有机溶剂反应体系酶溶解性好（亲水溶剂的毒害问题）溶解极性较高的底物，如糖水分含量大第二节反应体系...............第20页,共60页，2024年2月25日，星期天二两相体系

1常见的两相体系有机溶剂－水两相体系在有机溶剂－水两相体系中，多数酶分子处在水相中不与有机溶剂直接接触从而能保持较高活性；而大部分底物则溶解在有机相中，在水相中底物或产物的浓度较低这样可以避免底物或产物对酶产生的抑制作用。同时产物从酶分子表面脱落进入有机相中有利于反应向生成产物方向进行。还可实现反应和分离的耦合（同时进行）。存在着相界面，这样会给反应带来传质和传热阻力。同时相界面的存在还导致了酶的界面失活。而且在有些情况下溶解于水相的少量有机溶剂还能对酶的活性产生影响。...............第21页,共60页，2024年2月25日，星期天构建双水相体系实现在线产物分离TopphaseBottomphase

Substrates

Product

Product

Sideproduct

BiocatalystAquousTwoPhaseSystem--ATPS第22页,共60页，2024年2月25日，星期天2反相胶束体系

在水－有机溶剂两相体系和微水有机溶剂体系中，仅有少数酶能够保持催化活性，而能在反相胶束体系中催化的酶的种类更多(酶在胶束中水池中活力更大)。从一定意义上说，反相胶束体系也是一种两相体系，但它用于传质的相面积更大。

酶的重复利用和产物同步分离上仍存在许多问题

第23页,共60页，2024年2月25日，星期天微团效应使某些酶活性增加超活性：凡是高于水溶液中所得酶活性值的活性称为超活性（Super-activity）。认为：超活性是由围绕在酶分子外面的表面活性剂这通过与酶相关基团作用改变酶构象而影响酶活。第24页,共60页，2024年2月25日，星期天3氟溶剂的两相体系

催化中均相反应有利于底物传质,而两相体系有利于分离,氟溶剂这种可变为单相体系的两相体系同时拥有两种优点第25页,共60页，2024年2月25日，星期天

优点：无溶剂反应具有很高的底物浓度，在不存在底物抑制的情况下，有利于提高反应速度并推动反应向产物方向进行，从而得到高浓度的产物。因为在反应中没有使用有机溶剂，也就避免了有机溶剂对酶活性的影响。同时有机溶剂用量减少也在一定程度上提高了产品的安全性，这对于食品和医药工业是非常重要的，这也符合环境保护的要求。不使用溶剂就相应减小了反应器的体积，这对工业生产来说就是大大降低了生产成本，有利于工艺的工业化。反应结束后无需考虑从反应体系中分离出反应溶剂，简化了产物分离纯化工艺。缺点:但酶在无溶剂条件下进行催化也存在着许多困难和问题：高浓度的底物和反应中形成的产物可能对酶起抑制作用，这会对酶的催化活性产生不利影响；另外反应底物本身的黏度可能很大，可能会使底物与酶难以充分混合，从而导致反应速率过慢。其它体系1无溶剂反应体系第26页,共60页，2024年2月25日，星期天2拟低共熔反应体系所谓低共熔混合物，是指两种或两种以上的组分，在一定组分比率下会表现出比纯组分熔点低的低共熔点，并且多相共存。底物固、液相同时存在是低共熔混合物能被酶催化的原因。拟低共熔反应体系中进行酶催化反应，具有产物浓度高、对环境友好等许多优点，但也有研究者认为在该体系中调节酶的催化特性比较困难。第27页,共60页，2024年2月25日，星期天第三节影响酶在非水反应介质中催化的因素水对非水相酶催化的影响冻干保护剂对酶构象的影响反应介质对非水相酶催化的影响载体对非水相酶催化的影响第28页,共60页，2024年2月25日，星期天：（1）与酶分子表面带电基团结合达到0-0.07g/g（水/酶）（2）与表面的极性基团结合(0.07-0.25g/g)（3）凝聚到表面相互作用较弱的部位（0.25~0.38g/g）（4）酶分子表面完全水化，被一层水分子覆盖。一水对非水相酶催化的影响干燥的酶水合过程第29页,共60页，2024年2月25日，星期天水参与了所有维持酶活性构象的非共价结合力(静电力、范德华力、疏水相互作用及氢键)，因此水在酶催化中扮演着极其重要的角色。Visser和Reinhoudt等人等用时间分辨荧光光谱(Time-ResolvedFluorescence)研究了酶悬浮于有机溶剂中的结构构象，发现随着水化程度的提高，酶分子的柔性逐渐增加，酶活性也增加，这为水分子的润滑剂作用提供了更直接试验依据。这部分充当润滑剂的水分子称为”结构水”。极性有机溶剂可以夺取酶水化层的大部分水，甚至结构水。而非极性溶剂夺取水的能力较弱，因此在极性有机溶剂中酶容易丧失活性，而在非极性溶剂中，酶可以保持较高的催化活性和稳定性。水的作用第30页,共60页，2024年2月25日，星期天必需水（essentialwater）：维持酶分子完整的空间构象所必需的最低水量。例如：凝乳蛋白酶，只需５０分子的水。多酚氧化酶，需３５０个水分子。第31页,共60页，2024年2月25日，星期天过多水的危害过多的水分会进一步水化蛋白中极性低的基团使蛋白构象更松散引起一些构象微调来降低酶活性，尤其是酶的“热失活”；（物理）温度升高时酶分子发生可逆折叠，然后进行下述一种或几种反应：(1)形成不规则的结构；(2)通过消除反应使二硫键破坏；(3)天冬氨酸和谷氨酰氨残基的脱酰氨；(4)天冬氨酸残基的肽键水解。（化学）另外也有人认为太多的水会使酶积聚成团，导致疏水底物较难进入酶的活性部位，引起传质阻力。水分对不同形式酶的影响也不同，对于一些固定化酶来说，过多水分子在载体上的吸附有可能导致底物的传质限制；（传递）同时在有水生成的可逆反应(如酯化、酯交换)中，水分的存在也对反应的热力学平衡不利。（化学平衡）第32页,共60页，2024年2月25日，星期天酶最适含水量可以看出，在非水相酶反应体系中存在一个“最佳含水量”。该最佳含水量不仅取决于酶种类的不同，也与所选用的有机溶剂有关。通常最佳含水量极低，并未达到水在有机溶剂中的饱和点。早期的研究试图用向反应体系中的加水量来表示“最佳水含量”，事实上这并不恰当。因为体系中的水会在溶剂、酶、载体、甚至底物之间进行分配。Hailing提出用水的热力学活度(wateractivity,aw)表示非水相体系中的水含量，水活度的大小直接反映出酶分子上水分的多少，与体系的其他因素无关。

第33页,共60页，2024年2月25日，星期天第34页,共60页，2024年2月25日，星期天水活度的调控通常有两种情况可改变体系的水活度：反应中产生或消耗水；溶剂化作用或相行为水活度的调控，通常利用特定的水合盐对，通过以下两种操作方式获得恒定的水活度：将酶和含有底物的溶剂分别与盐的饱和溶液平衡至相同的水活度，然后混合进行反应，如右图所示；向干燥的反应器中直接加入一种高水合盐缓释部分水到体系中，本身变位低水合盐或无水盐，如Na2HPO4、Na2HPO4.2H2O、Na2HPO4.7H2O、Na2HPO4.12H2O。第35页,共60页，2024年2月25日，星期天二冻干保护剂对酶构象的影响

冷冻干燥是制备非水相催化用酶的一个重要手段，但冷冻干燥过程可能引起酶分子脱去”结构水”导致了酶构象的一些改变而影响酶的活性。kibanov等人利用傅立叶变换红外光谱(FT-IR)研究了蛋白质在冷冻干燥过程后构象的变化，发现冷冻干燥过程会诱导蛋白质二级结构的可逆性改变(重新加到缓冲液后蛋白构象会恢复)，冷冻干燥过程增加了蛋白质中B-折叠结构的含量而降低了a-螺旋结构的含量。加入冻干保护剂以后蛋白的二级结构与天然态蛋白(缓冲液中)的二级结构更相似第36页,共60页，2024年2月25日，星期天冻干保护剂有很多氢键,可在脱水过程中起着”氢键替代”作用,可弥补”结构水脱去引起蛋白构象变化;也有人认为冻干保护剂在冻干过程中包围在蛋白周围成玻璃态,防止蛋白分子间不正常聚集。冷冻干燥作为酶的脱水过程对酶的活性中心和二级结构都有一定损害作用，而冻干保护剂则可以一定程度上保护酶的活性中心和构象，同时一定的冻干保护剂还可以降低底物传质障碍，这也可能是冻干保护剂影响酶在非水相中催化活性的一个途径。第37页,共60页，2024年2月25日，星期天三反应介质对非水相酶催化的影响一般认为有机溶剂可以从如下几个方面影响酶的催化:(1)溶解于酶周围水分子层内的有机溶剂分子可与酶活性中心直接结合，或通过干扰氢键和疏水键等改变酶的构象，导致酶受抑制或引起酶失活、催化选择性的变化；

（1）对酶分子表面结构的影响；（2）对酶活性中心的影响。辣根过氧化物酶在甲醇中的催化时，发现甲醇可以进入到酶活性中心，与卟啉铁配位。4个乙睛分子可以进入到活性枯草杆菌蛋白酶活性中心，结合位点与抑制剂相似。第38页,共60页，2024年2月25日，星期天Klibanov等人用圆二色谱和核磁共振的方法检测了几种有机溶剂中溶菌酶(lysozyme)的构象，发现与溶菌酶在水中的天然构象相比，溶菌酶在乙二醇中为部分折叠状态，在甲醇中为“熔球”(moltenglobule)状态，而在甲酞胺、二甲基甲酞胺、二甲基亚矾(DMSO)中则呈现去折叠(unfold)状态。他们解释为甲酸胺等溶剂会破坏稳定蛋白构象的酞胺基团之间的氢键作用，而醇类和酞胺基团的氢键则要弱许多，因此对蛋白构象影响不同。第39页,共60页，2024年2月25日，星期天(2)有机溶剂会夺去酶分子表面的必需水分(结构水)，导致酶活性下降；枯草杆菌蛋白酶晶体在乙腈溶剂中，原有的119个与酶分子结合的水分子中有20个水分子被脱去，12个乙腈分子结合到了上去，其中4个取代了原来水分子的位置。第40页,共60页，2024年2月25日，星期天(3)由于酶一般不溶于有机溶剂而成聚集体，而造成底物传质困难；(4)有机溶剂与水之间的极性不同，在反应过程中会影响底物和产物的从宏观溶液到酶表面水膜分配，从而影响酶的催化反应。(5)控制底物的溶剂能或稳定反应的过渡态,改变反应能量。第41页,共60页，2024年2月25日，星期天四载体对非水相酶催化的影响

酶分散性立体屏蔽是由于载体的空隙太小，或者由于固定化方式与位置不当，给酶的活性中心或调节中心造成了空间障碍，因而底物与效应物无法和酶接触，从而影响酶活性的一种效应。对酶构象的影响酶构象改变主要是酶和载体的相互作用引起了酶的活性中心或调节中心的构象发生了改变，从而导致酶活性的下降。底物分配效应分配效应是由于固定化载体的亲水和疏水性质使酶的底物、产物以及其它效应物在微观环境与宏观体系间发生了不等分配，改变了酶反应系统的组成平衡，从而影响酶反应速度的一种效应。水的分配及酶上结合水的影响载体的亲水性越强，争夺水的能力就越强不利于维持酶的微水环境，使酶的活性构象受到影响。而疏水性载体利于水结合到酶分子周围，使酶保持高活性构象。最终固定化还需要考虑的因素有载体的表面积、颗粒大小、内部孔径大小等。

第42页,共60页，2024年2月25日，星期天五pH选择和离子强度的影响pH选择：在有机溶剂的环境中，不会发生质子化及脱质子化的现象。酶在水相的pH值可在有机相中保持，(pH记忆现象)同一种酶不同来源，对pH值敏感程度大不相同。可通过控制冻干前缓冲液pH值来达到控制pH的目的.第43页,共60页，2024年2月25日，星期天与“pH记忆”相似，蛋白质还具有配体“记忆”能力。蛋白质溶于高浓度配体溶液时，会形成大量弱结合复合物，冻干后用无水溶剂洗去配体，获得的蛋白质中会有许多由配体结合时留下的“印迹”，由于蛋白质在分子在无水溶剂中具有刚性，这些印迹得以保持，由此得到的蛋白质为“印迹蛋白质分子”。其在无水溶剂中表现出对原始配体的极大结合容量，这种选择性结合，可用于专一性催化、分离纯化、生物传感器。第44页,共60页，2024年2月25日，星期天第四节非水相酶催化反应中酶催化的调控通过酶工程方法调控基因水平的改造酶分子的化学修饰固定化酶冻干酶通过底物工程方法调控通过介质工程方法调控溶剂水活通过其它手段调控添加剂微波超声

第45页,共60页，2024年2月25日，星期天一酶工程１、冻干酶粉和结晶酶

目前最简单的也是被大多数研究者所采用的非水催化的体系是将固态酶粉直接悬浮在有机溶剂中。２、固定化酶酶固定化后，增大了酶与底物接触的表面，在一定程度上可以提高酶在有机溶剂中的扩散效果和热力学稳定性，有利于酶的回收和连续化生产。３、化学修饰酶双亲分子共价修饰或非共价修饰酶分子表面，可以增加酶表面的疏水性，使酶均一地溶于有机溶剂。第46页,共60页，2024年2月25日，星期天二底物工程酯交换反应中其中一个底物和产物都为酞基供体和酶都有结合能力，因而酯交换反应常常是可逆的，这将导致反应速度的下降。为此可采用过量的酰基供体，但这种方法代价昂贵而且给产物分离带来困难。最好的办法是选用或改造、使用特殊结构的底物作酞基供体以产生一个不可逆反应。第47页,共60页，2024年2月25日，星期天烯醇酯以烯醇酯作为酰基供体时(如乙酸乙烯酯或异丙烯酯)，反应将释放出不稳定的烯醇产物，它将很快自发地转变为稳定的醛或酮，从而有利于反应的进行。生成乙烯和丙酮任然对酶有毒性第48页,共60页，2024年2月25日，星期天有机介质中用脂肪酶(PSL)催化酯化用于γ-羟基-α,β-不饱和酯的拆分。可以避免副反应的发生。第49页,共60页，2024年2月25日，星期天三溶剂工程溶剂工程方法主要集中在两个方面：依据一些参数选择（如logP值）合适溶剂提高反应速率及选择性控制水活度第50页,共60页，2024年2月25日，星期天溶剂的性质与lgP最初，研究者认为溶剂的以下性质与酶催化活性具有很大的相关性：Hildebrand(希尔德布兰德)溶解度参数δ；介电常数ε；偶极矩μ；分配系数的对数lgP。溶剂理化性质相关系数gP①(%)2lgP0.900.1Hildebrand溶解度参数δ0.721介电常数ε-0.632~5lgP，为化合物在标准正辛烷-水两相体系中的分配系数的对数，严格意义上讲，lgP代表溶剂的疏水性(Hydrophobicity)，而非极性(Polarity)，但两者之间有密切的相关性。第51页,共60页，2024年2月25日，星期天剥离结构水溶解疏水底物不使其向酶表面水膜层扩散第52页,共60页，2024年2月25日，星期天第五节酶非水相催化的应用

酶催化反应应用

脂肪酶肽合成青霉素G前体肽合成酯合成醇与有机酸合成酯类转酯各种酯类生产聚合二酯的选择性聚合酰基化甘醇的酰基化蛋白酶肽合成合成多肽酰基化糖类酰基化羟基化酶氧化甾体转化过氧化物酶聚合酚类、胺类化合物的聚合多酚氧化酶氧化芳香化合物的羟基化胆固醇氧化酶氧化胆固醇测定醇脱氢酶酯化有机硅醇的酯化第53页,共60页，2024年2月25日，星期天一手性药物两种对映体的药理作用药物名称有效对映体的作用另一种对映体的作用普萘洛尔（Propranolol）萘普生（Neproxen）青霉素胺（Pe