分子遗传学基础-基因工程的操作程序（遗传学课件）

PCR扩增技术内容一二三四五聚合酶链式反应示意图PCR反应的条件PCR反应的温度循环周期PCR引物PCR技术的应用在1983年，美国Cetus公司人类遗传研究室的科学家K.B.Mullis发明的。

PCR是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，有称之为体外扩增法。聚合酶链式反应示意图一、聚合酶链式反应示意图PCR反应的温度循环周期二、PCR反应的温度循环周期PCR反应的温度循环周期二、PCR反应的温度循环周期三、PCR反应的条件PCR反应的条件PCR引物：与待扩增的靶DNA区段两端序列互补的人工合成的寡核苷酸片断。其长度通常在15~30个核苷酸之间。简并引物：简并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。

四、PCR引物1、基因组克隆2、突变体的鉴定和在PCR过程中有目的的添加核酸序列。五、PCR技术的应用：在引物的5’端参入额外的DNA序列Ti质粒介导的整合转化程序内容一二三四Ti质粒致瘤的分子机制Ti质粒的结构与功能共整合转化程序T-DNA染色体整合机制Ti质粒的改造二元共整合转化程序一、Ti质粒的结构与功能几乎所有的双子叶植物尤其是豆科类植物的根部常常会形成根瘤，其根部致瘤特性是由一种革兰氏阴性土壤农杆菌细胞内的野生型Ti质粒介导所致的。Ti质粒的图谱整个质粒160-240kb，其中T-DNA12-24kb。tms

的编码产物负责：合成吲哚乙酸；tmr

的编码产物负责：合成植物分裂素；tmt

的编码产物负责：合成氨基酸衍生物冠瘿碱。二、Ti质粒致瘤的分子机制(一)、损伤的植物根部会分泌出乙酰丁香酸和羟基乙酰丁香酸。

二、Ti质粒致瘤的分子机制（二）、它们能诱导Ti质粒上的vir基因以及根瘤菌染色体上的一个操纵子表达。二、Ti质粒致瘤的分子机制（三）、vir基因产物将Ti质粒上的T-DNA单链切下，而根瘤菌染色体上的操纵子表达产物则与单链T-DNA结合形成复合物。二、Ti质粒致瘤的分子机制（四）、复合物转化植物根部细胞二、Ti质粒致瘤的分子机制三、T-DNA的染色体整合机制四、Ti质粒的改造（一）、除去T-DNA上的生长素（tms）和分裂素（tmr）生物合成基因，因为大量的生长素和分裂素会抑止细胞再生长为整株植物；（二）、除去T-DNA上的有机碱生物合成基因（tmt）；因为有机碱的合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，影响植物细胞的生长；（三）、除去Ti质粒上的其它非必需序列，最大限度地缩短载体的长度；四、Ti质粒的改造（四）、安装大肠杆菌复制子，使其能在大肠杆菌中复制，以利于克隆操作；（五）、安装植物细胞的筛选标记，如使用植物基因的启动子和polyA化信号序列；（六）、安装多聚人工接头以利于外源基因的克隆。五、共整合转化程序六、二元整合转化程序（一）、将外源基因克隆在大肠杆菌-农杆菌穿梭质粒的T-DNA区内；（二）、重组质粒直接转化农杆菌株，该菌株携带只含vir区不含T-DNA区的Ti辅助质粒；以上述重组农杆菌感染植物细胞。基因工程的酶学基础—限制性核酸内切酶内容一二三命名断裂方式定义一、定义定义：这类酶又简称为限制性内切酶或限制酶。是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核苷酸内切酶。寄主控制的限制与修饰现象：人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。即所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉。R/M体系：寄主是由两种酶活性配合完成的，一种是修饰的甲基转移酶，另一种是核酸内切限制酶。EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列。R/M体系的作用：保护自身的DNA不受限制；破坏外源DNA使之迅速降解。二、命名限制性核酸内切酶的命名原则：第一个字母：大写，表示所来自微生物的属名第一个字母。第二、三字母：小写，表示所来自微生物种名第一、二个字母。其它字母：大写或小写，表示所来自的微生物的菌株号。罗马数字：表示该菌株发现的限制酶的编号。例：EcoRI来自于EscheriacoliRY13的第一个限制酶。三、断裂方式核酸内切酶作用后的断裂方式：（一）粘性末端：两条链上的断裂位置是交错地、但又是围绕着一个对称结构中心，这样形式的断裂结果形成具有粘性末端的DNA片断。具有3’-OH（Pst1），或5’-OH(EcoR1)的粘性末端。

Pst1EcoR15’CTGCAG3’5’GAATTC3’3’GACGTC5’3’CTTAAG5’三、断裂方式核酸内切酶作用后的断裂方式：（二）平末端

两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片断。不易重新环化。Sma15’CCCGGG3’

3’GGGCCC5’三、断裂方式核酸内切酶作用后的断裂方式：（三）同裂酶指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶。同裂酶进行同样的切割，产生同样的末端。但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同。（四）同尾酶指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。限制片断的末端连接作用：分子间的连接：不同的DNA片断通过互补的粘性末端之间的碱基配对而彼此连接起来。分子内的连接：由同一片断的两个互补末端之间的碱基配对而形成的环形分子。分子内连接分子间连接基因工程研究的主要内容或步骤内容一二基因工程研究的主要内容或步骤基因工程的支撑技术1、从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片段；切2、在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子；接一、基因工程研究的主要内容或步骤：3、将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（寄主细胞），并与之一起增殖；转4、从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了细胞重组DNA分子的受体细胞克隆；增一、基因工程研究的主要内容或步骤：5、从这些筛选出来的受体细胞克隆，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究使用；检6、将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。一、基因工程研