FISH.ppt

1、FISH技术在肿瘤病理诊断及肿瘤分子靶点治疗中的应用,细胞遗传学技术 原理：通过荧光标记的DNA探针与细胞核内的DNA 靶序列杂交 观察：荧光显微镜 原位观察（细胞、组织）细胞核 彩色探针信号 目的：获得细胞内多条染色体(或染色体片段)或多种 基因状态的信息。,Fluorescence in situ hybridization （FISH）,用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位,原理,centrome

2、re,telomere subtelomere,locus specific,whole chromosome paint,FISH探针的种类,操作流程简图,FISH技术在乳腺癌检测中的应用,乳腺癌 Her-2基因,致癌基因：Her-2基因； 位点：17q11.2-q12； 编码蛋白：跨膜蛋白（与 表皮生长因子受体部分同源）； 25-30%乳腺癌病人都有HER-2的扩增； HER-2基因扩增是决定Herceptin治疗是否有效的关键性指标。,Her-2基因的检测方法,Her-2基因FISH 探针组,结果判断,统计Ratio值（计数浸润性部分的20个细胞） Ratio值20个细胞核中红信号总数/

3、绿信号总数 Ratio1.8 为阴性结果 Ratio2.2或众多信号连接成簇时可不计算为阳性结果 比值24为低度扩增 410为中度扩增 10为高度扩增 Ratio在1.8-2.2 之间时，则需要再计数20个细胞核中 的信号。如仍为临界值，则应在FISH检测报告中注明。,A. 无须计数的大簇团信号（高度扩增）,B. 颗粒状信号（R10，高度扩增）,C. 须计数的颗粒状信号（R=3.5，低度扩增）,A,C,B,Her-2基因扩增状况,Her-2基因无扩增情况,红信号数2，同时绿信号非整倍体R1.8，无扩增,红信号与绿信号均为两点，R=1,荧光原位杂交与免疫组化检测Her-2结果比较,我实验室已完成

4、病例小结,IHC,0 1+ 2+ 3+,FISH,无扩增 13 3 4 0 20,扩增 2 2 10 29 43,总数,(n=15) (n=5) (n=14) (n=29) （n=63）,Her2表达IHC（2+）标本中，基因扩增率为71.41% Her2表达IHC（3+）标本中，基因扩增率为100%,（文献报道：90-95%）,30%的肿瘤细胞全部 的细胞膜高强度着色,免疫组化（3+）与FISH对比图,40,100,住院号：177319 浸润性导管癌级 IHC：+ FISH：呈簇团状高度扩增,100,30%的肿瘤细胞弱的着色,免疫组化（1+）与FISH对比图1,住院号：175689 浸润性导

5、管癌级 IHC：+ FISH： Ratio1.62，无扩增,免疫组化（1+）与FISH对比图2,40,100,住院号：175895 浸润性导管癌级 IHC：+ FISH：簇状扩增,30%的肿瘤细胞弱的着色,免疫组化（）与FISH对比图1,100,40,住院号：176846 浸润性导管癌级 IHC： FISH： Ratio1.02， Her2基因无扩增,30%的肿瘤细胞弱的着色或不着色,免疫组化（）与FISH对比图2,住院号：175472 浸润性导管癌级 IHC： FISH：呈簇状扩增,肿瘤细胞不着色,评价17号染色体的意义,17号染色体非整倍性：每个细胞中17号染色体多于或少于2个； 乳腺癌遗

6、传学特征之一，可能预示预后不良； 17号染色体多体性是导致IHC 3+但FISH检测为阴性的主要原因； 我实验室完成病例中17号染色体非整倍性发生率为33.3%。,评价Her-2基因状态的同时应考虑 17号染色体数目的变化,IHC与FISH结果不一致原因分析,IHC判断标准的主观性 内对照探针17号染色体着丝粒探针的建立， 排除IHC假阴性 IHC 2+及3+的基因检测结果分离，无法控制 由于17号染色体多体性造成假性扩增 IHC自身无法克服的缺陷,基因扩增是Herceptin 使用的关键性指标,Her2基因检测流程,石蜡组织标本,IHC检测,再用FISH 方法检测,1+,3+,2+,+,He

7、rceptin治疗,+,再用FISH 方法检测,Herceptin治疗,FISH检测,+,再用FISH 方法检测,+,乳腺癌HER2 FISH检测报告模板,FISH技术检测染色体易位在淋巴瘤分型中的应用,淋巴瘤的诊断与分型,难,HEIHC + cytogenesis = 解决!,不同类型的淋巴瘤有各自不同的染色体易位,使控制细胞发育分化过程中的关键蛋白失活,与淋巴瘤的发生密切相关,IGH/BCL2 t (14;18) (q32;q21) 染色体易位 IGH/MYC t (8;14) (q24;q32) 染色体易位 IGH/CCND1 t(11; 14)(q13;q32)染色体易位 API2/M

8、ALT1 t(11;18)(q21;q21)染色体易位 IGH/MALT1 t (14;18) (q32;q21)染色体易位 BCR/ABL t(9;22)染色体易位【费城染色体】,目前开展的染色体易位检测（6种）：,t (14;18) (q32;q21) 染色体易位,意义： t (14;18)易位后形成的IGH/BCL2基因能编码完整BCL2 蛋白，IGH基因附近的增强子使BCL2 过表达 t (14;18)为FL的标志（低级别更易出现）,检出率达93%100% DLBCL 20% 30%出现易位 影响检出率的原因： 石蜡标本中DNA的降解 FL3b接近DLBCL，其易位率低，影响总体检出率

9、,IGH/BCL2 Dual Color, Dual Fusion Translocation Probe,探针杂交示意图,肿瘤细胞核IGH/BCL2 双色双融合 易位探针杂交后显示1O1G2F信号,细胞核IGH/BCL2双色双融合 易位探针杂交后显示2O2G信号,病例1：会诊84363，男，74y 腹腔肿物； FISH：54%的细胞可见融合信号； 诊断：FL。,100,病例2：会诊84362，女、36 颈部肿物 抗炎治疗后（出现变性坏死） 诊断：DLBCL FISH：阳性，10%的细胞可见融合信号,t (8;14) (q24;q32) 染色体易位,意义： t (8;14)易位后形成的IGH/

10、MYC基因能编码完整MYC蛋 白，IGH基因附近的增强子使MYC过表达 应用范围： 所有Burkitt淋巴瘤都有t (8;14)易位 诊断不典型Burkitt淋巴瘤须有t (8;14)易位的MYC异常 可见于继发于滤泡性淋巴瘤的前驱B淋巴母细胞白血病/ 淋巴瘤,MYC,8q24 region,14q32 region,IGH/MYC, CEP8 Tri Color, Dual Fusion Translocation Probe,探针杂交示意图,正常细胞核IGH/MYC, CEP8 三色双融合易位探针杂交后显示2R2G2A信号,肿瘤细胞核IGH/MYC 双色双融合 易位探针杂交后显示1O1G2

11、F信号,10,40,病例3: 399318，女、5y 颈淋巴结活检； ISH: EBERs（+）； FISH:45%的细胞可见融合信号； 诊断：散发性经典型BL。,病例4: 405618，女，21y 盆腔肿物穿刺； ISH: EBERs（+）； FISH: 23%的细胞可见融合信号； 诊断：考虑为散发性经典型BL。,4,40,活检穿刺标本,病例5:399625，男、42y ISH:EBERs（-）； 经多学科大会诊； 诊断：较符合散发性非典型BL； FISH: 25%的细胞可见融合信号；,4,40,活检穿刺标本,t (11; 14)(q13;q32)染色体易位,意义 t (11;14)易位后形

12、成IGH/CCND1基因，IgH基因附近的增 强子使 Cyclin D1过表达 应用范围 套细胞淋巴瘤的诊断性指标 也出现过零星其它淋巴瘤t (11;14)易位的检出,IGH/CCND1Dual Color, Dual Fusion Translocation Probe,11q13 region,14q32 region,简洁示意图,探针杂交示意图,10,40,IHC:CyclinD1,病例6: 393301，男，40y； 肘部肿物； IHC：CyclinD1弱阳性； 经科内会诊； FISH:21%的细胞可见融合信号； 诊断：MCL,所示箭头为染色体易位 产生的融合信号（100）,10,CyclinD1,40,病例7: 386766，女，67y 扁桃体活检2块，直径0.3CM IHC：CyclinD1弱阳性； FISH:45%的细胞可见融合信号； 诊断：不排除MCL的可能，重取活检；,形态不典型+IHC不理想,FISH检测标本要求,新鲜活检或手术切除标本； 石蜡包埋组织或石蜡切片（35um）； 肿瘤穿刺活检组织或细胞涂片； 骨髓穿刺组织尽量送涂片，不用活检组织（因为脱钙需要使用盐酸，破坏DNA）； 肿瘤细胞阳性的胸腹水涂片； 一般在3个工作日后可以发出检测报告；,EBV-DNA定量PCR结果的稳定性分析,EBV-DNA定量PCR标准样品扩增曲线,鼻咽癌检测结果比较,5个不同样