增李斯特氏菌检测详解.ppt

1、进出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测方法SN/T 0184.1-2005,李斯特氏菌,样品的存放与制备,冷冻样品：应于25解冻，且不超过18小时；若不能及时检验，应置于15保存。 非冷冻的易腐样品：尽可能及时检验，若不能及时检验，应置于4冰箱保存，在24h之内检验。 无菌取样品25g(mL)放入灭菌均质杯或均质袋中加225mL FB1增菌液中，充分均质。,增菌培养,225mL FB1 301培养25h1h，吸取1mL，加入10mL FB2增菌液中301二次增菌25h1h。,VIDAS快速筛选（可选）,FB2增菌液进行VIDAS快速筛选。 筛选为阴性的结果可直接报告未检出。 筛选为阳性的结果继

2、续分离培养和鉴定。,分离培养,取增菌液一环，划线分离于选择性培养基OXA、PALCAM上，351培养24h48h。 菌落形态：24h后菌落呈现黑色，直径为1mm，在其周围形成一个黑色环。培养48h，菌落仍成黑色，直径2mm3mm，除在菌落周围有一环外，在菌落中心部位的深层也形成黑点。 挑取5个或更多的可疑菌落，接种于TSA-YE。,鉴定,蓝色菌落检验 用45斜射光照射TSA-YE平板，菌落呈现蓝灰色到蓝色。 （设标准菌株对照）,鉴定,典型运动镜检 李斯特氏菌为短棒状杆菌，可见轻微的旋转翻滚。 （设标准菌株对照） 注：压片法或悬滴法 暗光,鉴定,革兰氏染色 短杆状革兰氏阳性反应 注：陈旧培养物多

3、转为阴性。,鉴定,过氧化氢酶试验 挑取TSA-YE平板上的菌落于洁净载玻片上，滴加1滴3的过氧化氢溶液，李斯特氏菌呈过氧化氢酶阳性反应。,鉴定,溶血试验 刺种7羊血琼脂平板，并刺种阳性对照菌（单核细胞增生李斯特氏菌和绵羊李斯特氏菌）和阴性对照菌（英诺克李斯特氏菌），30培养24h48h。 单核细胞增生李斯特氏菌 窄小的溶血环 西尔李斯特氏菌 窄小的溶血环 绵羊李斯特氏菌 大的溶血环 其他 不溶血,鉴定,动力试验 穿刺SIM半固体培养基，于室温（2025）培养48h。 李斯特氏菌有动力，呈典型的伞状生长。,鉴定,硝酸盐还原试验 接种于硝酸盐肉汤，于35培养5d。 李斯特氏菌为阴性。,鉴定,MRV

4、P试验 接种于MRVP肉汤中，于35培养48h。 李斯特氏菌为阳性反应。,鉴定,三糖铁试验 接种于TSI，35培养5d。 李斯特氏菌斜面和底层产酸，不产硫化氢。,鉴定,尿素酶试验 穿刺尿素琼脂斜面，于35培养5d。 李斯特氏菌尿素酶试验阴性。,鉴定,糖发酵试验 接种0.5%葡萄糖、麦芽糖、七叶苷、甘露醇、鼠李糖、木糖发酵管内，35培养24h48h，阴性继续培养到第5天。,李斯特氏菌菌种鉴别特征,鉴定,协同溶血试验（cAMP） 在羊血琼脂平板上各划一直线，使两线平行，在平行线上分别接种金黄色葡萄球菌ATCC49444和马红球菌ATCC6939，在两线之间垂直接种，与两线相近但不相交，于35培养2

5、4h48h后，观察相交处溶血情况。,L. monocytogenes L. innocua L. ivanovii,窄的溶血带 不溶血 宽的溶血带,CAMP (Staphylococcus aureus),Staphylococcus aureus,Listeria monocytogenes,鉴定,API鉴定试验 可代替硝酸盐还原、MR-VP、三糖铁、糖发酵、尿素酶和CAMP等试验。,鉴定,血清学检验 菌悬液于80水域中加热1h，离心弃上清，剩余液与沉淀混匀制成菌悬液，进行血清学玻片凝集试验。 单核细胞增生李斯特氏菌：1/2A，1/2B，1/2C，3A，3B，3C，4A，4AB，4B，4C，4D，4E，7,质量控制,每次检验均需用标准阳性菌株和阴性菌株进行质量控制。 样品制备的同时，在空白对照FB1增菌液中加入新鲜配制的每毫升含有10个100个单核细胞增生李斯特氏菌的稀释液1mL和阴性培养物，按检验程序进行同步检验。,报告结果,协同溶血试验、血清学试验可根据需要进行，常规检验可不进行这些试验。 报告阳性结果：检出单核细胞增生李斯特氏菌。 报告阴性结果：未检出单核细胞增生李斯特氏菌。,新旧标准的主要不同,增菌培养基 EB Fraser 选择性培养基MMA O