广西地方标准《水牛胚胎冷冻保存技术操作规程》（征求意见稿）编制说明

1广西地方标准水牛胚胎冷冻保存技术操作规程（征求意见稿）编制说明一、任务来源本标准任务来源于广西壮族自治区质量技术监督局（桂质监函2017158号）关于下达2017年第三批广西地方标准制定（修订）项目计划通知批复的水牛胚胎冷冻保存技术操作规程标准，时间2017年7月至2017年12月。项目执行单位为广西水牛研究所。二、编制目的意义近年来，随着各级政府对奶水牛产业化的重视，广西乃至全国的奶水牛养殖业发展迅速，良种水牛的需求量逐渐超过了自然繁殖所能供给的数量。广西水产畜牧兽医局和我所正在推出的河流型良种水牛种源产业化实施方案，需要我所每年提供至少1000头良种水牛用于广西水牛的杂交改良，更是远远超过了我所水牛种畜场的生产能力。而超数排卵和体外胚胎生产技术可以利用有限的良种水牛资源生产尽量多的良种胚胎，而这些胚胎的推广和应用都依赖于胚胎冷冻保存技术。因此，如何高效的冷冻保存并且解冻移植水牛胚胎就显得极为重要。通过对体内和体外生产的水牛胚胎进行超低温冷冻，可以长期保存或者远距离运输良种水牛胚胎，对于水牛的良种杂交选育具有重要的意义。目前，由于各地对水牛胚胎冷冻的标准不统一，具体选择哪个评分标准，通常由每个实验室根据自己的情况确立。因此，必须尽快完成水牛胚胎冷冻保存技术操作规程地方标准制定，为水牛胚胎冷冻保存提供一个规范性文件依据，本标准的实施对促进高产、高效、优质的奶水牛业生产、加快我区乃至全国水牛杂交改良进程有着极其重要的意义。三、本标准编制的原则（一）政策性原则本标准中凡涉及国家相关法律法规和政策的内容和条款，均严格遵循。（二）实用性原则本标准是集各地的成功经验进行编制的，因此具有可操作性和实用性。（三）经济性原则本标准的内容主要来自于生产一线，并要服务于生产一线，因此以提高经济效益和确保社会效益与生态效益为原则。（四）规范性原则以TCS2009标准编写软件为模板，以国际标准分类法（ICS）和中国标准文献分类法（中标分类CCS）进行分类，按照GB/T11一2009的规则编排稿文本，因此具有规范性。2四、国内外标准对比情况查阅了标准网、广西金质网、地方法规标准数据库，国内没有与水牛胚胎冷冻技术相关的现行的国家、行业标准，及地方标准。目前尚未查到水牛胚胎冷冻技术规范的国外标准。五、编制过程（一）前期工作编制起草承担单位此前一直进行了水牛胚胎冷冻的相关研究，对于冷冻方法、冷冻液成分、解冻方法、冷冻胚龄、冷冻阶段、解冻液成分、胚胎种类等对水牛胚胎冷冻效果的影响进行了全面的研究，并且对冷冻胚胎进行了移植，研究了其胚胎移植效果。并且在THERIOGEOLOGY（影响因子2895）上发表了一篇水牛胚胎冷冻优化的文章。（二）成立编制起草小组为确保标准编制的顺利实施，做到编制的标准技术含量高，实用性强，确保编制标准高质量、高效率，由广西水牛研究所技术人员组成编制起草小组，对标准起草工作进行分工，明确任务和职责。编制起草小组由5名高级职称、3名初级职称人员共8人组成。具体见表1。表1主要起草人及其工作内容姓名职称负责项目具体内容杨春艳副研究员项目主持人，制定方案，主持起草水牛胚胎冷冻技术规范尚江华研究员数据收集郑海英高级畜牧师数据分析梁贤威研究员审核指导鄢胜飞研究实习员实验实施、数据整理李孟琪研究实习员实验实施、数据整理黄芬香高级畜牧师实验实施、数据整理于农淇研究实习员实验实施、数据整理（三）查阅相关文献2017年6月至2017年8月，收集、整理并总结项目组前期水牛胚胎冷冻相关试验数据、相关利用技术以及推广生产实际中的一些操作规程和经验，查阅国内外关于水牛胚胎冷冻的技术资料。资料有如下1H3UFANADURAND,PEDROPB,VENTURINAHV,HUFANARD,SALAZARAL,DURA4NPG,CRUZLCPOSTWARMINGHATCHINGANDBIRTHOFLIVECALVE5SFOLLOWINGTRANSFEROFINVITRODERIVEDVITRIFIEDWATER6BUFFALOBUBALUSBUBALISEMBRYOSTHERIOGENOLOGY2004611427914392MANJUNATHABM,GUPTAPSP,RAVINDRAJP,DEVARAJM,NANDIS8INVITROEMBRYODEVELOPMENTANDBLASTOCYSTHATCHINGRATE9SFOLLOWINGVITRIFICATIONOFRIVERBUFFALOEMBRYOSPRODU10CEDFROMOOCYTESRECOVEREDFROMSLAUGHTERHOUSEOVARIESO11RLIVEANIMALSBYOVUMPICKUPANIMREPRODSCI2008104419124263MANJUNATHABM,GUPTAPSP,RAVINDRAJP,DEVARAJM,NANDISEF13FECTOFVITRIFICATIONMEDIUMCOMPOSITIONANDEXPOSURETI14MEONPOSTTHAWDEVELOPMENTOFBUFFALOEMBRYOSPRODUCED15INVITROVETJ20091792872914GALLIC,CROTTIG,NOTARIC,TURI16NIP,DUCHIR,LAZZARIGEMBRYOPRODUCTIONBYOVUMPICKUPFR17OMLIVEDONORSTHERIOGENOLOGY200155134113575PARNPAIR,TASRIPOOK,KAMONPATANAMDEVELOPMENTPOTENTIALOFVITRIFIEDCLONEDSWAMPBUFFALOMORULAEDERIVEDFROMGRANULOSACELLSTHERIOGENOLOGY2001552846LAOWTAMMATHRONC,LORTHONGPANICHC,KETUDATCARINSM,HOCHISPARNPAIRFACTORSAFFECTINGCRYOSURVIVALOFNUCLEARTRANSFERREDBOVINEANDSWAMPBUFFALOBLASTOCYSTSEFFECTSOFHATCHINGSTAGE,LINOLEICACIDALBUMININIVCMEDIUMANDFICOLLSUPPLEMENTATIONTOVITRIFICATIONSOLUTIONTHERIOGENOLOGY200518511967ANDERS18ONRAPOLICYANDPRACTICESUBGROUPOFTHEBRITISHFERTIL19ITYSOCIETYASTRATEGYFORFUTUREREPRODUCTIVESERVICESF20ORSURVIVORSOFCANCERHUMFERTILCAMB200361131158VAJTAG,KUWAYAMAMIMPROVINGCRYOPRESERVATIONSYSTEMSTHERIOGENOLOGY2006652362449BA21IXJ,XUEJH,ZHANGXH,LUOMJ,LIJD,ZHANGCL,LIANGK,DONGYJ,SUZUK22ITFREEZINGBOVINEEMBRYOSIN18MOL/LETHYLENEGLYCOLE23GSUCROSESOLUTIONCHINJVETSCI20002040140410LIANGX24W,LUYQ,CHENMT,ZHANGXF,LUSS,ZHANGM,PANGCY,HUANGFX,LUKHIN25VITROEMBRYOPRODUCTIONINBUFFALOUSINGSEXEDSPERMAND26OOCYTESFROMOVUMPICKUPTHERIOGENOLOGY2008698228261127ARAVA,YAVINS,ZERONY,NATAND,DEKELI,GACITUAHNEWTRENDSIN28GAMETESCRYOPRESERVATIONMOLCELLENDOCRINOL2002187772981（四）标准征求意见稿（草案）形成2017年10月，根据收集及查找的相关资料和文献，形成标准草稿；在已有科技成果和技术资料的前提下，对区内外技术发展状况进行调查研究，收集分析有关标准和技术资料，吸收先进技术经验，进行必要的技术操作测试和验证，在此基础上起草完成标准征求意见稿（1稿），并编写标准编制说明（1稿）。（五）完善草案，形成标准送审稿将标准征求意见稿，分别送有关生产、技术推广、科研、教学和标准化等方面专家征求意见（详见附表一），形成征求专家意见汇总处理表（详见附表二）。共收回专家意见7份50条，根据专家意见修改完善标准征求意见稿，起草完成标准征求意见稿（第2稿）；将标准征求意见稿（第2稿）报送广西水产畜牧兽医局和标准化专业委员会审核，由自治区质量技术监督局在网上公开征求意见。根据网上征求意见，修改完善标准征求意见稿（第2稿），起草完成标准送审稿和完善编写标准编制说明。（六）标准报批稿形成，审定形成广西地方标准根据标准审定会专家提出的意见，修改完善标准送审稿，编写完成标准报批稿。将标准报批稿材料报送广西水产畜牧兽医局，经广西水产畜牧兽医局和标准化专业委员会审核，由自治区质量技术监督局作为广西地方标准颁布实施。6、关键技术指标依据和来源本标准水牛胚胎的程序化冷冻及玻璃化冷冻等关键技术指标主要来自我站开展的试验研究和收集生产单位的生产数据。（一）来源于试验研究。20082015年我所一直开展水牛体外生产配体、核移植胚胎、转基因胚胎等的程序化和玻璃化冷冻研究和示范推广等，收集到大量数据，并在SCI（影响因子2895）上发表了相关文章。主要试验数据如下表一程序化和玻璃化冷冻液成分对于水牛各类胚胎冷冻效果的研究（N6）存活率方法液体IVFEMBRYOSDERIVEDFROMABATTOIROVARIESIVFEMBRYOSDERIVEDFROMOPUSCNTEMBRYOS30A40EG63116732/53A64511120/30AA67516830/46AB25EG25DMSO78023357/69AB84111148/59ABB79614244/56AB玻璃化C20EG20DMSO05MSUCROSE88715443/48B91012843/47BA9238555/60BD10EG7523449/65AB程序化E005MTREHALOSEDEHYDRATE18EG04BSA64610539/59A由表一可见，对于屠宰场卵巢生产的IVF胚胎而言，程序化冷冻液D和E的冷冻效果差异不显著752VS646,P005，均与液体A631和B780相似，而液体C得到的胚胎存活率最高887。而对于OPUIVF胚胎和SCNT胚胎而言，液体C的胚胎冷冻存活率显著高于液体AP001。总体而言，冷冻液成分越多，冷冻效果越好。此外IVF胚胎和SCNT胚胎通过20EG20DMSO05M蔗糖冷冻后的解冻存活率没有显著差异。表二超低温冷冻胚胎的复苏时间（N6）方法NOOFEMBRYOSRECOVEREDIN024HNOOFEMBRYOSRECOVEREDIN2448HNOOFEMBRYOSRECOVEREDIN4872HTOTAL程序化26765A823534100玻璃化23489B20426510647100由表二可见，IVF胚胎通过液体D程序化冷冻和通过液体C玻璃化冷冻后，765的程序化冷冻胚胎在解冻后024H复苏，显著高于玻璃化冷冻胚胎489,P005235的程序化冷冻胚胎和426的玻璃化冷冻胚胎在解冻后2448H复苏，而仍然有106的玻璃化冷冻胚胎在解冻后4872H复苏。总之，对于IVF胚胎而言，程序化冷冻胚胎的复苏较之玻璃化冷冻胚胎早。表三水牛IVF和SCNT胚胎的发育阶段对冷冻效果的影响（N6）存活率发育阶段IVFEMBRYODERIVEDFROMABATTOIROVARIESIVFEMBRYODERIVEDFROMOPUSCNTEMBRYO31早期囊胚7359022/30A7745329/37A7344626/35A中期囊胚8487430/35AB8788433/38AB8567234/40B扩张囊胚9318337/39B9476134/40B9634436/38B由表三可见，扩张囊胚的冷冻效率屠宰场IVF胚胎931，OPUIVF947，SCNT囊胚963显著高于囊胚分别为848、878、856和早期囊胚分别为735、774、734P005。表4胚龄对水牛体外生产胚胎冷冻效果的影响（N6）存活率胚龄IVFEMBRYODERIVEDFROMABATTOIROVARIESIVFEMBRYODERIVEDFROMOPUSCNTEMBRYO5D009278631/34A6D9505934/36A9585736/38A9185644/48A7D9416829/31A9515731/33A9256545/49A8D65412119/29B6787419/28B6902929/42AB9D5364214/26B5574211/23B5433118/33BB由四可见，对于屠宰场卵巢生产的IVF胚胎而言，胚龄为6天和7天的囊胚其冷冻存活率分别为950和941，显著高于8天654和9天的囊胚536P001。对于OPUIVF胚胎而言，第6和第7天囊胚的冷冻存活率分别为958和951，显著高于8天678和9天的囊胚557P001。对于SCNT胚胎而言，第5天、6天和7天的囊胚冷冻存活率分别为927、918和925，显著高于