《蔬菜中阿维菌素残留的测定 酶联免疫吸附法》编制说明

贵州省食品安全地方标准蔬菜中阿维菌素残留的测定酶联免疫吸附法编制说明（征求意见稿）北京勤邦生物技术有限公司1、任务来源本标准的制定是根据“贵州省重大科技专项计划项目”“贵州省茶叶、蔬菜质量安全评价、检测、预警与可追溯关键技术研究与应用”项目要求而确定的，同时根据贵州省卫生和计划生育委员会办公室关于同意贵州苕粉等25项贵州省食品安全地方标准立项的通知（黔卫计办函201594号）文件的通知要求，我单位承担的茶叶、蔬菜中阿维菌素残留的快速检测酶联免疫吸附法贵州地方标准于2015年11月获得立项。2、标准制定的背景和必要性阿维菌素（AVERMECTIN，AVMS）是由链霉菌菌株STRPTOMYCESAVERMITILIS代谢产生的一组大环内酯类抗生素，具有很高的杀虫活性，被誉为是近20年来抗寄生虫药物研究的重大突破。其结构新颖，作用机制独特，对多种农作物的害螨和害虫具有很高的生物活性，是一种优良的抗生素、杀虫剂、杀螨剂，且具有广谱、高效、低残留和对人畜及环境安全等特点。虽然阿维菌素类药物的作用剂量较小（NG/KG级），但是此类药物的脂溶性高，且具有神经毒性和发育毒性，在动物体内的残留时间长，世界卫生组织（WHO）5级分类标准中将其列为高毒化合物。世界各国均对蔬菜和水果中的AVMS有着严格的限量规定，联合国粮食及农业组织/世界卫生组织（FAO/WHO）规定的阿维菌素类药物在水果中的最大残留限量（MAXIMUMRESIDUELIMIT，MRL）为001002MG/L；欧盟规定水果、黄瓜、豆类中的MRL为20G/KG；2006年日本实施的肯定列表制度规定它在农产品中的MRL值执行一律标准，即10G/KG；我国也规定了结球甘蓝、菠菜、普通白菜（小油菜除外）、莴苣、芹菜、大白菜、豇豆的MRL为50G/KG，花椰菜的MRL为500G/KG，小油菜、菜豆的MRL为100G/KG，番茄、甜椒、黄瓜的MRL为20G/KG，茄子的MRL为200G/KG。贵州属传统的农业省，农业人口和农业产业比重较大。近年来，我省充分发挥资源优势，加大农业结构调整力度，突出抓好蔬菜、茶叶等优势特色产业。蔬菜面积1763万亩，蔬菜已成为我省农业结构调整的支柱产业和农民收入的主要来源。然而随着我省蔬菜产业的不断发展壮大，质量安全也逐渐凸显。茶叶、蔬菜中残留的农药会通过食物链进入人体，危害人类健康，而且农产品会因质量安全问题被进口国（地区）拒绝、扣留、退货、索赔和终止合同，制约我省的经济发展。因此，加强蔬菜等农产品中阿维菌素等农药的检测和控制是一项刻不容缓的工作。本项目建立阿维菌素的酶联免疫吸附（ELISA）法，采用特异性强的单克隆抗体，检测灵敏度可达到1G/KG，对蔬菜样本的最低检测限为5G/KG，满足FAO/WHO规定的最大残留限量，样本加标回收率为70110，检测结果准确度高，并且该方法具有特异性强、快速方便、不需要昂贵仪器设备等优点，适合大批量样品的集中快速筛查，可为我省蔬菜等农产品的质量安全监管控制提供技术支撑和重要保障。3、国家标准、行业标准以及其他省外标准的制定发布情况在国际标准化组织（ISO）标准体系、国际分析化学师协会（AOAC）标准体系和欧盟标准委员会（CEN）标准体系中，均尚未检索到阿维菌素的检测方法标准；我国标准体系中提供了阿维菌素的检测方法标准14项，其中国家标准10项（GB/T207482006、GB/T213192007、GB/T213202007、GB/T213212007、GB/T229532008、GB/T229682008、GB296952013、GB296962013、GB23200202016、GB23200192016）、农业部公告3项（农业部781号公告52006、农业部1025号公告52008、农业部1486号公告52010）、出入境检验检疫标准1项（SN/T26612010），其中仅有1项标准适用于蔬菜SN/T21142008进出口水果和蔬菜中阿维菌素残留量检测方法液相色谱法。该标准采用的液相色谱法操作繁琐耗时，仪器设备昂贵，且需要专业的技术人员，仅适用于实验室检测，在现场监管检测和企业质量内控工作中有其局限性，不能满足我省对蔬菜农产品中阿维菌素的快速检测需求。4、主要工作过程、主要编制成员、参加成员1、主要工作过程该标准由北京勤邦生物技术有限公司（以下简称勤邦生物）组织专家成立了标准编制工作组，并负责编制起草工作，确定标准的主要技术内容。编制组成立后，进行了广泛的调查和研究工作，主要包括以下几个方面（1）详细查阅了国内、国外有关标准和相关专业期刊上发表过的参考文献等技术资料，并对这些资料进行了详细的对比，从方法的先进性、可靠性和实用性等几个方面考虑，选取了几个代表性的参考资料作为标准起草中的主要技术参考文本。（2）及时购置相关的实验试剂、标准品和其他材料；已将阿维菌素与羟胺反应得到阿维菌素半抗原；将阿维菌素半抗原与牛血清白蛋白和卵清蛋白分别进行偶联得到免疫原和包被原；已将制备获得的抗原通过免疫小鼠获得阿维菌素单克隆抗体；完成抗原抗体筛选、配对，获得最优抗原、抗体稀释倍数组合；建立了酶联免疫吸附法的反应体系，摸索不同条件对方法进行最优化，最终确定了最佳的检测方法。（3）针对蔬菜样品与其他参考资料中样品之间的差异，开展多种蔬菜酶联免疫吸附法的试验，包括白菜、胡萝卜，这是方法的重要步骤和关键环节。不同样品用同一种方法进行试验和验证，确保本检测方法能够灵敏、特异、准确地检测出蔬菜样品中阿维菌素的含量。如方法的检测限，对20份空白样本进行检测，以检测结果的平均值加上3倍标准差来确定检测限；方法的准确率，通过对5G/KG、10G/KG、20G/KG三种浓度添加的蔬菜样本进行检测，得到本检测方法的回收率，盲样测定与仪器方法的结果进行比对，确保本方法的检测结果可靠。（4）在技术指标完成试验工作之后，严格按照标准样本的格式，起草编写标准文本内容和编制说明内容。2、主要成员、参加成员序号标准名称主要编制成员参加成员1蔬菜中阿维菌素残留的测定酶联免疫吸附法贵州省农产品质检中心、北京勤邦生物技术有限公司蔡韬、冯才伟、扶胜、陆洋、袁旭、卢平、李占斌、吴小胜、王震、周雪莉、罗华兰、丁静五、标准主要内容确定的依据1、主要技术内容的确定依据技术内容确定的依据方法的检测限为5G/KG，主要是依据我国政府规定的结球甘蓝、菠菜、普通白菜（小油菜除外）、莴苣、芹菜、大白菜、豇豆的MRL为50G/KG，花椰菜的MRL为500G/KG，小油菜、菜豆的MRL为100G/KG，番茄、甜椒、黄瓜的MRL为20G/KG，茄子的MRL为200G/KG。本方法的检测限，完全能够符合相关部门的要求。方法的定量限、准确率、特异性等技术指标确定主要依据一是兽药残留检测试剂盒（条、卡）备案技术资料要求及审查工作程序的规定要求；二是农业部农牧发20031号文件“关于发布兽药残留试验技术规范（试行）的通知”中的规定要求；三是按照国际食品法典委员会（CAC）通用要求。其他参数、公式、性能要求、实验方法、检验规则等主要依据包括GB/T112009标准化工作导则第1部分标准的结构和编写规则ISOIECDIRECTIVES,PART3,1997,RULESFORSTRUCTUREANDDRAFTINGOFINTERNATIONALSTANDARD,NEQ；GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法。2、标准技术内容和技术指标的论证21酶联免疫吸附法主要材料制备211半抗原的合成阿维菌素是小分子物质，不具备免疫原性，只有反应原性，需与大分子载体蛋白共价结合后才能使动物免疫系统识别，产生相应的抗体。本研究先对阿维菌素小分子进行结构改造获得具有羧基官能团的半抗原，与蛋白质分子中的氨基反应，形成肽键，从而可将半抗原与载体蛋白（BSA、OVA等）偶联制备人工抗原。将阿维菌素与羟胺反应得到具有羧基官能团的半抗原，具体操作如下阿维菌素与PDC在吡啶催化下60度反应，氧化糖苷中醇羟基为酮，经提取，纯化得到酮基阿维菌素，在与羟胺缩合反应，得到四碳链长度间隔臂的半抗原产物，经核磁鉴定，结构正确，鉴定图谱如下图1阿维菌素半抗原结构式鉴定氢谱图212抗原的合成2121免疫原的合成将阿维菌素半抗原与牛血清白蛋白进行偶联得到免疫原，具体操作如下取5MG阿维菌素半抗原用1MLDMF溶解，取30MGEDC和NHS用02ML水充分溶解后加入阿维菌素半抗原溶液中，室温下搅拌24H，即可得到反应液A；称取50MGBSA充分溶解在38MLPBS（PH72）中，将反应液A逐滴缓慢加到蛋白溶液中，于室温下搅拌24H；用001MOL/LPBS于4透析3D，每天换液34次，以除去未反应的小分子物质；分装，于20保存备用。2122包被原的合成将阿维菌素半抗原与卵清蛋白进行偶联得到包被原，具体操作如下取5MG阿维菌素半抗原用1MLDMF溶解，取30MGEDC和NHS用02ML水充分溶解后加入阿维菌素半抗原溶液中，室温下搅拌24H，即可得到反应液A；称取50MGOVA充分溶解在38MLPBS（PH72）中，将反应液A逐滴缓慢加到蛋白溶液中，于室温下搅拌24H；用001MOL/LPBS于4透析3D，每天换液34次，以除去未反应的小分子物质；分装，于20保存备用。2123阿维菌素免疫原与包被原的鉴定方法确定偶联是否成功一般通过紫外扫描法鉴定半抗原与载体蛋白的偶联是否为有效偶联，因为半抗原与蛋白在紫外下有不同的特征吸收，当偶联成功时，偶联物的紫外吸收会有二者的叠加效应出现，因此比单独的蛋白特征吸收会发生一定的偏移，可用于检测偶联是否成功。偶联比的测定用纯水稀释阿维菌素半抗原、BSA、OVA及两种蛋白与阿维菌素半抗原的结合物，配制成一定浓度的溶液，然后用紫外分光光度计进行全波长扫描，得到它们的紫外吸收光谱图。根据公式KA/CL分别计算出阿维菌素半抗原、BAS、OVA的摩尔消光系数。在载体蛋白和阿维菌素半抗原的最大波长处检测偶联物的光吸收值，按公式计算两种物质在偶联物中的摩尔浓度比，即偶联比CA/CB（A偶264KBSA280A偶280KBSA264）/（A偶280K阿维菌素264A偶264K阿维菌素280）蛋白含量的测定将偶联物稀释到适当倍数后，测定280NM和260NM的分光光度值，按公式计算蛋白的浓度即偶联物的浓度蛋白质（MG/ML）145OD280074OD260免疫原和包被原的鉴定结果将阿维菌素半抗原、载体蛋白以及两者的结合物配制成一定浓度的溶液，然后用紫外分光光度计进行全波长扫描，经过计算分析得到人工抗原的结合比和浓度。阿维菌素BSA和阿维菌素OVA结合比分别为61和81。213抗体的制备2131动物免疫以阿维菌素BSA作为免疫原，免疫雌性BALB/C小鼠（810周龄）。免疫方案如下首免时，每只小鼠用150G的阿维菌素BSA（以载体蛋白计）与FCA按13比例混合制成的乳化剂，颈背部皮下多点注射；二免和三免时，将FCA换成FICA，剂量和方法同上。每次免疫间隔时间为2周。融合前3天每只小鼠腹腔注入100G阿维菌素BSA进行加强免疫。2132单克隆抗体的制备三免后第7天，采血清测效价。效价达16105以上的小鼠于四免后第12天，摘除眼球放血，并分离阳性血清作对照。无菌操作取小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合（比例数81）。融合剂为聚乙二醇（PEG）4000，作用2MIN，随后即加入20ML无血清的1640营养液（时间4MIN）。离心后，用20ML完全营养液悬浮混匀。将细胞悬液分别加入已铺有饲养细胞的96孔细胞培养板中（4板），01ML/孔置37饱和湿度、含5CO2的培养箱中培养。待细胞长至孔底的1/21/3时，用间接竞争ELISA方法筛选。阳性细胞迅速扩大培养并采用有限稀释法进行亚克隆。1014天后，取细胞上清检测，计算阳性率。阳性率100时，得到稳定的细胞株。采用体内诱生腹水法进行大量单克隆抗体的制备，将BALB/C小鼠（68周龄）腹腔注入灭菌石蜡油05ML/只，10天后，再注入阳性细胞1106个/只，植入细胞后第7天起，每天观察小鼠腹部，待小鼠腹部明显膨大，用9针头穿刺腹腔抽取腹水。每只小鼠可采腹水约23ML/次。离心去脂肪层和细胞层后，用饱和硫酸铵法纯化，分装冻存。阳性细胞经过3次亚克隆，阳性率达90，得到了2株稳定分泌单克隆抗体的细胞。22检测方法的建立221抗原、抗体的筛选1）用常规包被液（PH96，005MOL/L的碳酸盐缓冲液）将1、2、3抗原分别进行12104、14104、18104稀释，包被酶标板100L/孔，37恒温避光反应2H，PBST洗液洗涤1次，用常规封闭液（PH72，含有5卵清蛋白，01MOL/L磷酸盐缓冲液）封闭，37恒温避光反应2H，甩干；2）向板孔中加入标准品溶液（浓度为1G/L的阿维菌素）100L；3）加入用常规抗体稀释液（PH72，含有8牛血清白蛋白，01MOL/L磷酸盐缓冲液）稀释14105，16105，18105的1、2酶结合抗体工作液各100L，振荡混匀，25避光反应30MIN，用PBST洗液洗板3次；4）加入底物A液和B液各50L，25反应20MIN，加入50L终止液终止；5）按以上操作方法，分别测定零标准品OD值及1G/L标准品的OD值，计算抑制率，以零标准品OD值为1520，1G/L标准品抑制率为7080作为评定标准，选择较好的抗原抗体组合和抗原抗体工作浓度见表1（A）（B）。表1（A）方阵法确定最佳的抗原、抗体及最佳的工作浓度（表格中W表示1104）1抗原2抗原3抗原抗体稀释倍数检测项目12W14W18W12W14W18W12W14W18W0G/L标准品OD值2442197414172902250521022164185815421G/L标准品OD值229517171204267023801766179616161480140W抑制率（）9487859295848387960G/L标准品OD值1663143811952612229419861876165313841G/L标准品OD值143012221099242919961728161314381163160W抑制率（）8685929387878687840G/L标准品OD值1394116109742105170115171614140811791G/L标准品OD值1213110309641768144613501340119710731抗体180W抑制率（）879599848589838591表1（B）方阵法确定最佳的抗原、抗体及最佳的工作浓度（表格中W表示1104）1抗原2抗原3抗原抗体稀释倍数检测项目12W14W18W12W14W18W12W14W18W0G/L标准品OD值2806249320741953170213762017173614441G/L标准品OD值241323431763164114981293179515101199140W抑制率（）8694858488948987830G/L标准品OD值2484194616981619145512631634141811971G/L标准品OD值226016351460136012371086134011061017160W抑制率（）9184868485868278850G/L标准品OD值2179175613751438113009071123092206281G/L标准品OD值1787133511411265093808250921077404212抗体180W抑制率（）827683888391828467由表1（A）（B）可知，1抗原14104稀释，2酶结合物抗体工作液18105稀释时，零标准品OD值在1520之间，1G/L标准品抑制率为76，符合要求。222反应温度确定1）包被抗原用常规包被液将1抗原进行14104稀释，包被酶标板100L/孔，37恒温避光反应2H，用PBST洗液洗涤1次，用常规封闭液封闭，37恒温避光反应2H，甩干；2）加样方式向板孔中加入标准品溶液100L、用常规抗体稀释液稀释18105的2酶结合物抗体100L，混匀，分别在25、37下避光反应30MIN，用PBST洗液洗板3次；3）加入底物A液和B液各50L，25反应15MIN，加入50L终止液终止；4）按照以上操作方法，分别测定零标准品OD值、1G/L标准品OD值、空白白菜样本OD值，计算抑制率，以零标准品OD值为1520，空白蔬菜样本OD值接近零标准品OD值，抑制率在7080为判定标准，选择较好的反应温度（见表2）。表2反应温度的确定试验反应温度零标准品OD值1G/L标准品OD值抑制率（）空白白菜OD值25181213157317143720031825911842由表2可知，25条件下，加入100L标准品溶液、100L酶结合物抗体工作液反应后，测定的零标准品OD值在1520之间，1G/L标准品的抑制率在7080之间，空白蔬菜样品的OD值与零标准品OD值偏差较小。223抗原、抗体反应时间确定1）包被抗原用常规包被液将1抗原进行14104稀释，包被酶标板100L/孔，37恒温避光反应2H，用PBST洗液洗涤1次，用常规封闭液封闭，37恒温避光反应2H，甩干；2）加样方式向板孔中加入标准品溶液100L、用常规抗体稀释液稀释18105的2酶结合物抗体工作液100L，混匀，分别在25下避光反应15、30、60MIN，用PBST洗液洗板3次；3）加入底物A液和B液各50L，25反应20MIN，加入50L终止液终止；4）按照以上反应方式，测定零标准品OD值，重复两次，每次做6个对照孔，计算不同反应时间测定值的变异度CV（见表3）。表3抗原、酶结合物抗体反应时间确定测定项目抗原、酶结合物抗体反应时间（MIN）153060第一次第二次第一次第二次第一次第二次140013821821171122562289159614711635181522492409102814001754177221692034111612181804184021372238136713521613179023072296OD值140212491905181522882464板间CV1174751由表3可知，加入标准品100L、酶结合物抗体工作液100L，25反应30MIN，零标准品OD值均在1520，且变异相对较小224底物液显色时间的确定1）包被抗原用常规包被液将1抗原进行14104稀释，包被酶标板100L/孔，37恒温避光反应2H，用PBST洗液洗涤1次，用常规封闭液封闭，37恒温避光反应2H，甩干；2）加样方式向板孔中加入标准品溶液100L、用常规抗体稀释液稀释18105的2酶结合物抗体工作液100L，混匀，25下避光反应30MIN，用PBST洗液洗板3次；3）加入底物A液和B液各50L，25反应10、15、20或30MIN，加入50L终止液终止；4）按照以上反应方式，分别测定零标准品OD值，1G/L标准品OD值，空白蔬菜样本OD值，计算1G/L标准品的抑制率，以零标准OD值为1520，空白白菜样本OD值接近零标准品OD值，1G/L标准品抑制率在7080为判定标准，选择底物液显色时间（见表4）。表4底物液显色时间的筛选试验显色时间（MIN）零标准品OD值1G/L标准品OD值抑制率（）空白白菜OD值101305091570121515182614067718032022871740762123由表4可知，底物液显色时间为15MIN时，零标准品OD值在1520之间，空白白菜OD与零标准品OD值偏差较小，1G/L标准品的抑制率在7080。225包被液的筛选1）包被抗原用1、2、3、4包被液将1抗原进行14104稀释，包被酶标板100L/孔，37恒温避光反应2H，用PBST洗液洗涤1次，用常规封闭液封闭，37恒温避光反应2H，甩干；2）加样方式向板孔中加入标准品溶液100L、用常规抗体稀释液稀释18105的2酶结合物抗体工作液100L，混匀，25下避光反应30MIN，用PBST洗液洗板3次；3）加入底物A液和B液各50L，25反应15MIN，加入50L终止液终止；4）按照以上反应方法，分别测定零标准品OD值，1G/L标准品OD值，每种包被液设置2次重复，以零标准OD值为1520，1G/L标准品抑制率在7080为判定标准，选择合适的包被液（见表5）。表5包被液筛选的试验（N2）1包被液2包被液3包被液4包被液零标准品平均OD值12512314176819111G/L标准品平均OD值0815203613461216平均抑制率（）65887664由表5可知，当包被液为3时，零标准OD值为1795，在1520之间，1G/L标准品抑制率为73，在7080之间。226封闭液的筛选1）包被抗原用3包被液将1抗原进行14104稀释，包被酶标板100L/孔，37恒温避光反应2H，用PBST洗液洗涤1次，用1、2、3、4封闭液封闭，37恒温避光反应2H，甩干；2）加样方式向板孔中加入标准品溶液100L、用常规抗体稀释液稀释18105的2酶结合物抗体工作液100L，混匀，25下避光反应30MIN，用PBST洗液洗板3次；3）加入底物A液和B液各50L，25反应15MIN，加入50L终止液终止；4）按照以上反应方法，分别测定零标准品OD值，1G/L标准品OD值，每种封闭液设置3次重复，以零标准OD值为1520，1G/L标准品抑制率在7080为判定标准，选择合适的封闭液（见表6）。表6封闭液的选择试验（N3）零标准品平均OD值1G/L标准品平均OD值平均抑制率（）零标OD值CV1封闭液2311191683262封闭液1842130271273封闭液1346110282434封闭液2315196385113由表6可知，选择2封闭液时，零标准OD值为1834，在1520之间，1G/L标准品抑制率为71，在7080之间，且变异系数较小。227封闭条件筛选1）包被抗原用3包被液将1抗原进行14104稀释，包被酶标板100L/孔，37恒温避光反应2H，用PBST洗液洗涤1次，用2封闭液封闭，37恒温避光反应2H、4恒温避光反应16H，甩干；2）加样方式向板孔中加入标准品溶液100L、用常规抗体稀释液稀释18105的2酶结合物抗体工作液100L，混匀，25下避光反应30MIN，用PBST洗液洗板3次；3）加入底物A液和B液各50L，25反应15MIN，加入50L终止液终止；4）按照以上反应方法，整板测定零标准品OD值，重复测定2次。以零标准OD值为1520，变异相对较小且节省时间为判定标准（见表7）。表7封闭条件筛选（N2）封闭条件零标准品平均OD值零标准OD值板内CV37恒温避光反应2H1815434恒温避光反应16H161257由表7可知，用2封闭液，在37恒温避光反应2H时，零标准OD值为1815，在1520之间，变异相差不大情况下，实际操作更便利。228抗体稀释液的筛选1）包被抗原用3包被液将1抗原进行14104稀释，包被酶标板100L/孔，37恒温避光反应2H，用PBST洗液洗涤1次，用2封闭液封闭，37恒温避光反应2H，甩干；2）加样方式向板孔中加入标准品溶液100L、用1、2、3、4抗体稀释液稀释18105的2酶结合物抗体工作液100L，混匀，25下避光反应30MIN，用PBST洗液洗板3次；3）加入底物A液和B液各50L，25反应15MIN，加入50L终止液终止；4）按照以上反应方法，分别测定零标准品OD值、1G/L标准品OD值、9G/L标准品OD值和9G/KG白菜样品OD值，每种抗体稀释液设置2次重复，以零标准OD值为1520、1G/L标准品抑制率在7080、9G/L标准品OD值和9G/KG添加的白菜样品OD值偏差较小为判定标准，确定抗体稀释液（见表8）。表8抗体稀释液的筛选试验（N2）零标准品平均OD值1G/L标准品平均OD值抑制率（）9G/L标准品平均OD值9G/KG蔬菜平均OD值1抗体稀释液1764100757052105402抗体稀释液2216203692060106033抗体稀释液2142157474057905514抗体稀释液169512027104380447由表8可知，4抗体稀释液测定的零标准OD值在1520之间，1G/L标准品抑制率为71，在7080之间，9G/L标准品OD值和9G/KG添加的白菜样品OD值偏差均较小。229稀释后酶结合物抗体稳定性实验将用4抗体稀释液稀释18105的2酶结合物抗体置于37烤箱中保存，观察其在6天内的检测情况。1）包被抗原用3包被液将1抗原进行14104稀释，包被酶标板100L/孔，37恒温避光反应2H，用PBST洗液洗涤1次，用2封闭液封闭，37恒温避光反应2H，甩干；2）加样方式向板孔中加入标准品溶液100L、用4抗体稀释液稀释18105的2酶结合物抗体工作液100L，混匀，25下避光反应30MIN，用PBST洗液洗板3次；3）加入底物A液和B液各50L，25反应15MIN，加入50L终止液终止；4）按照以上反应方法，分别测定零标准品OD值，1G/L标准品OD值，每次检测设置2次重复，以零标准OD值为1520且6天内下降幅度不大于25、1G/L标准品抑制率在7080为判定标准（见表9）。表9稀释后的抗体保存性试验（N2）稀释液种类37保存时间零标准品平均OD值1G/L标准品平均OD值抑制率（）1天1913143575212341016824天10250911895天086405125946天0523021441由表9可知，4抗体稀释液稀释18105的2酶结合物抗体置于37烤箱中保存，零标准OD值为1520且6天内下降幅度较大，因此本项目中酶结合物工作液以浓缩液的形式保存，在需要使用时根据需要量将酶结合物浓缩液用酶结合物稀释液按照110体积比进行稀释。2210建立的检测方法的综合评价及标准曲线的建立1）根据上述方式选定的原材料的浓度、加样方式、反应温度、反应时间为分析条件，用浓度为0G/L、1G/L、3G/L、9G/L、27G/L、81G/L的阿维菌素标准溶液进行ELISA检测，测定OD值。2）以阿维菌素药物浓度对数值（LGAVI，G/L）为横坐标，各对应浓度的抑制率（B/B0）为纵坐标，制作标准曲线，计算回归方程及相关系数，根据线性方程计算IC50。以优化的ELISA条件，对所有浓度的标准溶液进行测定，每个浓度设置3个重复，根据测定结果制作标准曲线，测定零标准品OD值、IC50、变异系数、R2、1G/L标准品抑制率及对空白白菜样本添加9G/KG的回收率（见表10）。表10综合试验结果（N3）测定项目零标准品OD值IC50R21G/L标准品抑制率（）9G/KG白菜的回收率（）测定平均值1756460998181890阿维菌素标准品浓度（G/L）图2试剂盒标准曲线（标准品浓度分别为0，1，3，9，27，81G/L）23蔬菜样本前处理方法1）用均质器均质组织样本；2）称取茶叶、白菜试样10G005G于50ML聚苯乙烯离心管中，加10ML甲醇，涡动5MIN，混匀；3）3000G室温（2025/6877）离心5MIN；4）取1ML上层澄清液至10ML洁净干燥的玻璃试管中，于5060（122140）水浴氮气流下吹干；5）加入100L甲醇，涡动30S,再加入900L复溶工作液，涡动1MIN，充分混合，取50L用于分析。24检测方法技术参数确定241灵敏度分别测定3个批次试剂盒标准曲线的IC50抑制浓度，确定该值浮动范围，测定结果见表11。表11阿维菌素酶联免疫试剂盒IC50统计表抑制率（）批号IC50（G/L）第一批535146585461第二批525357556059第三批615853616054IC50的平均值56标准曲线IC50范围4661由以上测定结果可知，阿维菌素酶联免疫快速检测试剂盒标准曲线IC50值的波动范围为4661G/L。最低检测限为阿维菌素试剂盒测定实际样本的最小可检出量，其高低关系到试剂盒能否实际应用问题。由于在前处理过程中样本提取程序较多，而且受许多客观因素（样品的种类、样品来源地区、技术人员操作熟练程度等）影响，故回收结果有一定的差异。经测定后统计，本试剂盒符合该类试剂盒样本回收测定要求。结果见表12表13。表12空白白菜测定结果统计表（G/KG）样本号J1J2J3J4J5J6J7J8J9J10测定值21001200231500210030样本号J11J12J13J14J15J16J17J18J19J20测定值00260011002300001300平均值10（检测限计算公式）标准差11最低检测限43LODX3其中X为重复测定空白样品的平均值，N为样品数量。表13空白胡萝卜测定结果统计表（G/KG）样本号J1J2J3J4J5J6J7J8J9J10测定值00130000160000230015样本号J11J12J13J14J15J16J17J18J19J20测定值00002600000614000000平均值06（检测限计算公式）NX2X2NN1标准差09最低检测限32LODX3其中X为重复测定空白样品的平均值，N为样品数量。总结本试剂盒空白白菜的最低检测限为43G/KG，空白胡萝卜的最低检测限为32G/KG。242准确度和精密度准确度是指测定值与真实值间的符合程度，试剂盒的准确度常用回收率表示；精密度是反映测定方法对某一特定样品多次测定所得结果的重复程度，常用变异系数表示。以5G/KG、10G/KG、20G/KG三个浓度分别对白菜、胡萝卜样品进行添加回收试验，每种样品做6个平行，每个样本重复2次，计算添加样本回收率和批内、批间变异系数，结果见表14。表14样品准确度及精密度试验添加浓度123456回收率平均值批内CV批间CV白菜实测值369405428526417431回收率7380810085601052083408620859122实测值428461526497386400回收率8560922010520994077208000899123实测值4564825143894364275回收率91209640102807780872085409019797实测值8568411056924736784回收率8560841010560924073607840866130实测值8908419969287351041回收率8900841099609280735010410905122实测值815836918805104296410回收率8150836091808050104209640897106114实测值186314522156167316401782回收率931572601078083658200891088113620实测值194520451532183117001498879126122NX2X2NN1回收率9725102257660915585007490实测值186514301589186719482014回收率9325715079459335974010070893127胡萝卜实测值462402367388467527回收率9240804073407760934010540871138实测值385492401375510482回收率7700984080207500102089640882137实测值4284675244854353875回收率8560934010480970087007740909106121实测值8699841045753714768回收率8690984010450753071407680856158实测值7538968459651056806回收率7530896084509650105608060887125实测值864815830902831106210回收率8640815083009020831010620884105123实测值186315201496153719482045回收率9315760074807685974010225867141实测值163518201765182419271634回收率81759100882591209635817088465实测值14971568175221361987186320回收率7485784087601068099359315900136113在5G/KG、10G/KG和20G/KG浓度处的准确度范围为70110，批内、批间变异系数均小于20。243仪器比对随即抽取白菜、胡萝卜样品各20份，用本方法和仪器方法分别进行检测。仪器方法按照SN/T21142008进出口水果和蔬菜中阿维菌素残留量检测方法液相色谱法中所述的检测方法，方法的检出限为001MG/KG。本检测方法对白菜、胡萝卜样品的检测限为5G/KG。三种样本均以仪器方法检出限为阳性判定线，低于阳性判定线的值，检测结果以“”表示，高于或等于阳性判定线的值以实际检测结果表示，结果见表15表16。表15仪器比对结果（白菜样本）单位G/KG样品试剂盒液相色谱样品试剂盒液相色谱1112123134156163141671825156167178189405398191020302274表16仪器比对结果（胡萝卜样本）单位G/KG样品试剂盒液相色谱样品试剂盒液相色谱1112287296123134145156369340167178181892009191046543120从上表15表16可以看出，该试剂盒检测方法与仪器方法符合度达到100，可以用于白菜、胡萝卜样品中阿维菌素残留量的检测。244稳定性试验取生产的阿维菌素试剂盒用于稳定性试验的测定，包括冷热稳定性测定、28保存期测定。将制备好的试剂盒保存于28环境下，分别在8个时间段（第0、1、2、3、6、9、12、15月）取出做保存试验，测定其零标准品的OD值，IC50，5G/KG、10G/KG、20G/KG添加的白菜、胡萝卜的回收率；并将试剂盒保存于37和20环境中，在4个时间段（第0、3、6、9天）取出做加速和冻融试验，测定结果见表17。表17试剂盒稳定性试验阳性样本回收率（）温度时间最大吸光度值IC50（G/L）白菜胡萝