不同条件对哈茨木霉菌株ThB菌丝生长的影响

第 19 卷 第 6 期 云 南 农 业 大 学 学 报 Vol1 19 No1 62004 年 12 月 Journal of Yunnan Agricultural University Dec. 2004不 同 条 件 对 哈 茨 木 霉 菌 株Th2B 菌 丝 生 长 的 影 响 X李 栎 ,何 月 秋 3 3 ,苏 春 丽( 云 南 农 业 大 学 植 物 保 护 学 院 ,云 南 昆 明 650201 )摘 要 : 对 木 霉 菌 Th2B 的 生 长 温 度 、 pH范 围 、 碳 氮 营 养 要 求 以 及 对 6 种 常 用 化 学 杀 菌 剂 的 耐 受 程 度 进 行 了 研 究 。结 果 表 明 ,该 菌 株 在 15 35 下 均 能 生 长 ,其 最 适 生 长 温 度 为 25 30 ;在 pH 5 8 之 间 均 能 生 长 ,最 适 的 pH范 围 为 5 6 ; 蔗 糖 、 甘 露 糖 、 葡 萄 糖 、 木 糖 和 淀 粉 有 利 于 菌 丝 生 长 ,而 麦 芽 糖 和 D - 半 乳 糖 较 差 。 在 7 种 氮 源 中 ,胰 蛋 白 胨 和 硫 酸 铵 为 最 适 氮 源 ,而 尿 素 不 利 于 菌 丝 生 长 。 6 种 化 学 杀 菌 剂 不 同 有 效 浓 度 对 其 均 有 抑 制 作 用 ,但在 同 一 有 效 浓 度 下 ,速 克 灵 对 木 霉 菌 株 Th2B 的 抑 制 作 用 最 大 ,菌 核 净 、 瑞 毒 霉 和 甲 基 托 布 津 对 其 生 长 的 抑 制 作用 较 小 。关 键 词 : 木 霉 菌 ; 菌 丝 生 长 ; 碳 氮 营 养中 图 分 类 号 : S 47611 文 献 标 识 码 : A 文 章 编 号 : 1004 - 390X(2004) 06 - 0677 - 04Mycelium Growth of the Trichoderma harziarumStrain Th2B under Different ConditionsLI Li , HE Yue2qiu , SU Chun2li( College of Plant Protection , Yunnan Agricultural University , Kunming 650201 , China )Abstract : A Trichoderma harzianum strain , Th2B , with potential application value was studied in the me2dia on its temperature , pH value , nutrients of carbon and nitrogen sources and durability to 6 commonchemicals based on mycelium growth. The results showed that Th2B may grow at 15 35 and optimally at25 30 . It could grow at pH 5 8 and optimally pH 5 6. Sucrose , mannose , glucose , xylose andstarch were beneficial to its growth compared with maltose and D - galactose. Peptide and ammonium sulfatewere the best nitrogen for its growth , but urea was the worse among the 7 nitrogen sources. Although 6chemicals inhibited the growth of Th2B in different effective concentrations , sumilex inhibited Th2B moststrongly compared with carbendazim , dimethachlon , Ridomil , thiophanate2methyl and tricyclazole in thesame concentrations.Key words : Trichoderma harzianum ; mycelium growth ; carbon and nitrogen nutrient木 霉 菌 ( Trichoderma spp. )是 一 类 普 遍 存 在 的 、具 有 广 谱 性 的 拮 抗 生 防 菌 。 WEINDING于 1934 年首 次 报 道 了 木 霉 菌 的 拮 抗 特 性 1 ,2 ,并 建 议 将 该 菌用 于 土 传 植 物 病 害 的 生 物 防 治 ,揭 开 了 木 霉 菌 生 防研 究 序 幕 ,许 多 研 究 者 对 木 霉 菌 做 了 大 量 研 究 ,包括 木 霉 菌 的 形 态 结 构 、 分 布 、 分 类 、 生 防 机 制 、 发 酵X 收 稿 日 期 : 2004 - 05 - 25 3 3 通 讯 作 者基 金 项 目 : 云 南 省 科 技 攻 关 项 目 (2001NG35)作 者 简 介 : 李 栎 (1978 - ) ,女 ,辽 宁 省 盘 锦 市 人 ,在 读 硕 士 生 ,从 事 植 物 病 害 生 物 防 治 研 究 。生 产 、 田 间 应 用 等 方 面 ,并 取 得 了 显 著 成 果 3 7 。由 于 木 霉 菌 的 适 应 性 和 作 用 范 围 广 、 作 用 机 制 多 8 并 且 不 同 菌 株 间 的 这 些 特 点 差 异 较 大 9 ,因 此 ,研究 某 一 具 体 木 霉 菌 株 的 特 点 对 其 开 发 应 用 具 有 重要 意 义 。 木 霉 菌 株 Th2B 是 一 个 具 有 很 好 防 病 能 力的 菌 株 ,为 了 今 后 更 好 地 开 发 应 用 该 菌 株 ,本 文 就其 生 物 学 方 面 进 行 了 初 步 研 究 。1 材 料 与 方 法1. 1 菌 种 来 源木 霉 菌 株 Th2B 于 2000 年 从 昆 明 市 呈 贡 县 斗南 蔬 菜 大 棚 土 壤 中 分 离 得 到 ,属 哈 茨 木 霉 ( Tricho2derma harzianum) 。1. 2 培 养 基采 用 的 培 养 基 有 : 马 铃 薯 蔗 糖 固 体 培 养 基(PSA) ,马 铃 薯 液 体 培 养 基 ( PS) 和 木 霉 菌 基 础 培 养基 硫 酸 镁 (MgSO4 7H2O) 0. 2 g , 磷 酸 氢 二 钾(K2HPO4 ) 0. 9 g , 氯 化 钾 ( KCl ) 0. 15 g , 硫 酸 铵 (NH4) 2SO4 1 g ,蔗 糖 3 g ,五 氯 硝 基 苯 ( PCNB 的75 %可 湿 性 粉 剂 ) 0. 2 g ,孟 加 拉 红 (五 氯 四 碘 荧 光 燃料 C20H4O5Cl4) 0. 033 g ,琼 脂 20 g ,蒸 馏 水 1 000 mL ,调 pH至 6. 0. 在 研 究 碳 源 和 氮 源 的 影 响 时 ,分 别 用不 同 的 含 碳 和 含 氮 化 合 物 取 代 基 础 培 养 基 中 的 蔗糖 和 硫 酸 铵 。 所 用 的 碳 源 有 :葡 萄 糖 、 麦 芽 糖 、 D2半乳 糖 、 D2木 糖 、 蔗 糖 、 淀 粉 、 乳 糖 、 甘 露 糖 ;氮 源 有 :硝酸 钠 、 尿 素 、 胰 蛋 白 胨 、 牛 肉 膏 、 甘 氨 酸 、 谷 氨 酰 氨 ,分 别 设 无 糖 和 无 氮 的 空 白 对 照 。1. 3 供 试 农 药 及 有 效 浓 度 (g/ mL)多 菌 灵 (50 %多 硫 超 微 可 湿 粉 ) 为 江 苏 爱 谱 诺化 工 有 限 公 司 产 品 ,速 克 灵 (50 %可 湿 性 粉 剂 ) 为 广州 市 中 龙 化 工 有 限 公 司 产 品 ,使 用 的 有 效 浓 度 为510 10 - 6 ,510 10 - 7 ,510 10 - 8及 510 10 - 9 ;三环 唑 (20 %可 湿 性 粉 剂 )为 上 海 东 风 农 药 厂 产 品 ,菌核 净 (40 %超 微 可 湿 性 粉 剂 ) 为 成 都 市 福 达 集 团 公司 产 品 ,甲 基 托 布 津 (70 %可 湿 性 粉 剂 )为 日 本 营 达株 式 会 社 产 品 ,瑞 毒 霉 (58 %可 湿 性 粉 剂 ) 为 瑞 士 诺华 公 司 产 品 ,这 4 种 药 剂 使 用 的 有 效 浓 度 为 510 10 - 4 ,510 10 - 5 , 510 10 - 6 , 510 10 - 7 及 510 10 - 8 .1. 4 菌 株 的 培 养 10 ,11 测 定 最 适 生 长 温 度 时 ,温 度 设 15 ,20 ,25 ,30 和 35 等 5 种 不 同 温 度 ;测 定 光 照 、 pH 及化 学 杀 菌 剂 的 影 响 ,以 及 其 它 试 验 均 在 直 径 90 mm的 培 养 皿 中 放 入 6 mm 菌 饼 ,在 25 的 人 工 气 候 箱中 ,培 养 48 h 时 测 定 菌 落 直 径 大 小 (cm) ,每 个 处 理4 皿 ,重 复 3 次 ,其 中 温 度 、 光 照 、 pH 及 化 学 杀 菌 剂是 在 PSA 培 养 基 上 进 行 。 碳 源 和 氮 源 试 验 是 在 液体 培 养 基 中 进 行 。 于 100 mL 的 小 三 角 摇 瓶 中 装 入30 mL 培 养 基 ,移 菌 饼 (直 径 为 6 mm) 1 枚 。 在 28 下 110 120 r/ min 培 养 72 h ,然 后 用 滤 纸 过 滤 菌 丝 ,放 入 干 燥 箱 中 65 干 燥 48 h. 光 照 影 响 试 验 设 3个 处 理 :24 h 完 全 黑 暗 、 光 照 与 黑 暗 12 h 交 替 、 24 h完 全 光 照 (20 W 日 光 灯 ,距 培 养 物 15 cm) 。 pH 值影 响 试 验 设 pH值 5 ,6 ,7 和 8 等 4 个 梯 度 。1. 5 数 据 统 计所 有 实 验 数 据 均 采 用 SPSS ( Release 11. 50) 统计 软 件 进 行 统 计 ,计 算 处 理 间 的 差 异 显 著 性 。2 结 果 与 分 析2. 1 温 度 和 pH值 的 影 响木 霉 菌 株 Th2B 在 PSA 培 养 基 上 生 长 的 结 果 表明 (表 1) ,该 菌 株 在 15 35 下 均 能 生 长 ,以 2530 较 为 适 宜 ,25 为 最 适 生 长 温 度 。 温 度 低 于20 或 高 于 30 时 ,其 菌 落 直 径 显 著 下 降 。 在 pH5 8 之 间 均 能 生 长 ,但 在 偏 酸 条 件 较 中 性 和 碱 性条 件 下 生 长 得 好 些 ,最 适 的 pH范 围 是 5 6. 在 pH7 以 上 时 ,菌 落 直 径 显 著 下 降 。表 1 木 霉 菌 株 Th2B 在 不 同 温 度 、 pH 值 条 件 下 的 菌 落 直 径Tab1 1 Diameters of T . harzianum strain Th2B at thedifferent temperatures and pH values温 度 / 平 均 菌 落直 径 / cm pH值 平 均 菌 落直 径 / cm15 1. 73 eD 3 5 6. 77 aA20 5. 11 cB 6 6. 73 aA25 7. 62 aA 7 5. 52 bB30 7. 20 bA 8 4. 99 cC35 2. 36 dC3 不 同 的 小 写 英 文 字 母 和 不 同 的 大 写 字 母 分 别 表 示在 = 0. 05 和 = 0. 01 水 平 上 显 著 (下 同 ) 。2. 2 碳 源 和 氮 源 的 影 响在 无 糖 的 基 础 培 养 基 上 ,木 霉 菌 株 Th2B 的 生长 最 差 ,表 明 该 菌 株 需 要 糖 作 为 碳 源 和 能 源 ,但 在8 种 碳 源 中 ,蔗 糖 、 甘 露 糖 、 葡 萄 糖 、 木 糖 和 淀 粉 为最 适 碳 源 ,麦 芽 糖 和 D2半 乳 糖 较 差 ,乳 糖 最 差 。 与糖 源 相 比 ,氮 源 对 菌 丝 生 长 的 影 响 更 为 显 著 。 在 相同 的 基 础 培 养 基 中 ,无 氮 源 时 ,Th2B 菌 落 约 为 无 糖876 云 南 农 业 大 学 学 报 第 19 卷时 的 1/ 5. 在 供 试 的 7 种 氮 源 中 ,胰 蛋 白 胨 和 硫 酸铵 为 最 适 氮 源 ,而 尿 素 为 最 差 的 氮 源 ,其 它 几 种 氮源 之 间 差 异 较 小 (表 2) 。表 2 木 霉 菌 株 Th2B 在 不 同 碳 源 培 养 基 上 的 菌 落 直 径Tab1 3 Diameters of T. harzianum strain Th2B on the mediawith different carbon and nitrogen sources碳 源 菌 丝 干 重 / mg 氮 源 菌 丝 干 重 / mg葡 萄 糖 27. 33 abcABC 硫 酸 铵 19. 5 abA麦 芽 糖 20. 10 bcdBC 硝 酸 钠 11. 27 bcABCD - 半 乳 糖 17. 50 cdBCD 尿 素 5. 37 aAD - 木 糖 26. 63 abcABC 胰 蛋 白 胨 20. 33 cdBC蔗 糖 35. 97 aA 牛 肉 膏 13. 67 abAB淀 粉 26. 20 abcABC 甘 氨 酸 13. 47 abAB乳 糖 15. 33 dCD 谷 氨 酰 氨 14. 47 abAB甘 露 糖 30. 37 abAB 无 氮 0. 97 dC无 糖 5. 50 eD2. 3 光 照 的 影 响木 霉 菌 株 Th2B 对 光 照 无 明 显 特 别 要 求 ,它 在不 同 光 照 时 间 处 理 下 均 生 长 良 好 。 但 在 3 个 处 理中 ,光 照 与 黑 暗 12 h 交 替 处 理 的 生 长 速 度 略 快 于完 全 光 照 和 完 全 黑 暗 的 两 种 处 理 。2. 4 杀 菌 剂 的 影 响6 种 农 药 的 不 同 浓 度 对 木 霉 菌 株 Th2B 均 有 抑制 作 用 ,并 存 在 显 著 差 异 (表 3) 。 在 相 同 的 有 效 浓度 时 ,多 菌 灵 和 速 克 灵 抑 制 作 用 最 大 ,菌 核 净 和 瑞毒 霉 抑 制 作 用 最 小 ,甲 基 托 布 津 和 三 环 唑 的 抑 制 作用 居 中 。 在 有 效 浓 度 为 510 10 - 7时 ,菌 核 净 和 瑞毒 霉 已 基 本 没 有 抑 制 作 用 。 但 在 有 效 浓 度 为 510 10 - 8时 ,多 菌 灵 和 速 克 灵 仍 有 显 著 抑 制 作 用 ,抑制 率 (空 白 对 照 菌 落 直 径 - 处 理 菌 落 直 径 / 空 白 对照 菌 落 直 径 ) 100 %分 别 为 14. 03 %和 15. 00 % ,在 有 效 浓 度 为 510 10 - 9时 ,多 菌 灵 和 速 克 灵 的 抑制 率 仍 然 达 5. 97 %和 3. 59 %.表 3 不 同 农 药 浓 度 下 木 霉 菌 株 Th2B 的 菌 落 直 径Tab1 3 Diameters of T. harzianum strain Th2B with the bactericides of different concentrations cm浓 度 / (g mL - 1) 多 菌 灵 速 克 灵 三 环 唑 菌 核 净 瑞 毒 霉 甲 基 托 布 津空 白 对 照 7. 20 aA 7. 20 aA 7. 20 aA 7. 20 aA 7. 20 aA 7. 20 aA510 10 - 4 0. 8 eE 0. 60 dD 3. 21 cC 1. 62 eE510 10 - 5 2. 67 dD 3. 73 cC 5. 20 bB 2. 26 dD510 10 - 6 1. 88 eE 1. 66 eE 5. 58 cC 6. 46 bB 5. 32 bB 5. 26 cC510 10 - 7 5. 39 dD 3. 68 dC 6. 48 bB 7. 13 aA 7. 08 aA 5. 79 bB510 10 - 8 6. 19 cC 6. 12 cB 510 10 - 9 6. 77 bB 6. 95 bA 3 讨 论试 验 中 供 试 的 木 霉 菌 株 Th2B 具 有 非 常 好 的 防治 植 物 病 害 的 潜 在 能 力 以 及 生 产 成 制 剂 的 良 好 条件 。 为 了 能 更 好 地 为 工 厂 化 生 产 服 务 ,了 解 其 在 自然 条 件 下 的 适 用 范 围 ,本 文 就 温 度 、 pH 值 、 光 照 、 碳源 、 氮 源 及 6 种 杀 菌 剂 对 其 菌 丝 生 长 影 响 做 了 初 步研 究 。 结 果 表 明 ,它 的 生 长 较 适 温 度 在 20 30 之 间 ,最 适 生 长 温 度 为 25 . 当 培 养 温 度 超 出 较适 范 围 时 ,温 度 变 化 对 其 生 长 的 影 响 十 分 明 显 。 云南 省 呈 贡 县 地 区 终 年 气 温 多 在 15 28 ,由 此 分离 到 的 木 霉 菌 株 Th2B 最 适 温 度 也 在 25 左 右 ,这与 从 不 同 生 态 环 境 下 分 离 得 到 的 木 霉 菌 株 对 生 长温 度 条 件 的 要 求 不 同 12 ,13 的 报 道 相 一 致 。 因 此 ,在 利 用 该 菌 株 进 行 病 害 防 治 时 ,要 考 虑 到 施 用 时 的温 度 和 地 理 学 温 度 上 相 似 的 地 区 ,以 利 它 在 环 境 中定 殖 和 更 好 地 发 挥 作 用 。木 霉 菌 株 Th2B 在 pH 5 6 的 条 件 下 生 长 较好 ,这 与 很 多 文 献 上 报 道 的 大 多 数 木 霉 属 的 真 菌 在偏 酸 性 的 条 件 下 生 长 较 好 的 结 果 相 一 致 。 在 本 试验 中 测 得 淀 粉 是 该 菌 株 较 好 的 碳 源 ,表 明 木 霉 菌 具有 显 著 的 降 解 多 糖 的 能 力 14 。 因 此 ,在 发 酵 生 产时 ,可 以 用 易 于 获 得 且 成 本 低 廉 的 多 糖 做 为 碳 源 。木 霉 菌 株 Th2B 对 于 氮 源 和 光 照 基 本 上 没 有 特 殊 的要 求 ,但 是 尿 素 不 宜 作 为 发 酵 生 产 时 的 氮 源 。目 前 对 植 物 病 害 生 物 防 治 的 地 位 还 有 不 同 看法 ,主 要 原 因 是 单 独 使 用 化 学 杀 菌 剂 或 单 独 使 用 生防 菌 剂 均 有 其 自 身 的 缺 点 ,单 独 使 用 化 学 杀 菌 剂 存在 着 化 学 残 留 超 标 的 问 题 。 据 2003 年 全 国 蔬 菜 化学 残 留 抽 样 调 查 ,我 国 蔬 菜 化 学 残 留 超 标 情 况 严976第 6 期 李 栎 ,等 :不 同 条 件 对 哈 茨 木 霉 菌 株 Th2B 菌 丝 生 长 的 影 响重 ,其 中 云 南 省 超 标 率 居 全 国 第 三 。 单 独 使 用 生 防菌 剂 仍 存 在 很 多 问 题 ,如 防 治 效 果 往 往 不 很 理 想 或见 效 慢 。 另 外 ,由 于 化 学 杀 菌 剂 对 生 防 菌 剂 有 着 或多 或 少 的 毒 害 作 用 ,致 使 两 者 使 用 很 难 统 一 。 因此 ,研 究 如 何 兼 顾 生 防 菌 剂 与 化 学 杀 菌 剂 两 者 的 优点 ,避 其 缺 陷 尤 为 重 要 。 本 研 究 试 图 通 过 测 定 6 种使 用 范 围 较 广 的 化 学 杀 菌 剂 对 木 霉 菌 株 Th2B 生 长的 抑 制 作 用 ,为 合 理 地 将 该 菌 株 与 这 6 种 杀 菌 剂 混合 或 在 它 们 使 用 后 ,确 定 使 用 受 影 响 较 小 的 时 期 提供 依 据 。 结 果 表 明 ,多 菌 灵 对 木 霉 菌 株 Th2B 的 抑制 作 用 最 大 ,即 使 在 510 10 - 9时 ,对 Th2B 仍 有5197 %的 抑 制 作 用 。 而 菌 核 净 、 瑞 毒 霉 和 甲 基 托 布津 对 这 一 菌 株 影 响 较 其 它 农 药 小 得 多 ,在 有 效 浓 度为 510 10 - 5时 ,抑 制 率 分 别 为 48119 % ,27178 %和68191 %. 本 试 验 中 供 试 的 6 种 化 学 杀 菌 剂 在 大 田中 防 治 病 害 时 使 用 的 有 效 浓 度 一 般 为 110 10 - 2 210 10 - 4 ,除 瑞 毒 霉 抑 制 率 为 55142 %外 ,其 它 5种 农 药 对 该 生 防 菌 株 具 有 很 大 的 抑 制 作 用 。 因 此 ,不 能 将 这 些 化 学 杀 菌 剂 和 该 生 防 菌 株 同 时 施 用 ,也不 能 在 这 些 杀 菌 剂 施 用 后 的 很 短 时 间 内 施 用 Th2B制 剂 。参 考 文 献 1 WEINLING R. studies on a lethal principle effective in theparasitic action of Trichoderma lignorum on Rhizoctoniasolani and other soil fungi J . Phytopathology , 1934 , 24 :1 153 - 1 179.2 WEINDLING R. Isolation of toxic substances from the cul2ture filtrates of Trichoderma and Glicladium J . Phy2topathology , 1937 ,27 :1 175 - 1 177.3 文 成 敬 ,陈 文 瑞 ,陶 家 凤 . 棉 田 土 壤 木 霉 种 群 分 布 和生 物 活 性 J . 植 物 病 理 学 报 ,1992 , 22 (4) :306.4 文 成 敬 ,陶 家 凤 . 中 国 西 南 地 区 木 霉 属 分 类 研 究 J .真 菌 学 报 , 1993 ,12 (2) :118 - 130.5 王 艳 丽 ,沈 瑛 ,徐 同 . 哈 茨 木 霉 防 治 水 稻 纹 枯 病 研 究J . 植 物 保 护 学 报 ,2000 , 27 (2) :97 - 101.6 徐 同 . 木 霉 分 子 生 物 学 研 究 进 展 J . 真 菌 学 报 ,1996 ,15 (2) :143 - 148.7 AHMED S A , SANCHEZ C P , CANDELA M E. Evalua2tion of induction of systemic resistance