胰蛋白酶的分离纯化及动力学研究

实验论文胰蛋白酶的分离纯化及动力学研究学 院： 化工与材料学院生物工程专 业： 姓 名： 班 级：学 号： 指导老师：中国珠海二一六年四月北京理工大学珠海学院实验论文诚信承诺书本人郑重承诺：本人承诺呈交的毕业设计胰蛋白酶的分离纯化及动力学研究是在指导教师的指导下，独立开展研究取得的成果，文中引用他人的观点和材料，均在文后按顺序列出其参考文献，设计使用的数据真实可靠。本人签名： 北京理工大学珠海学院实验论文3日期： 年 月 日北京理工大学珠海学院实验论文I胰蛋白酶的分离纯化及动力学研究摘要本实验通过用有机溶剂沉淀法和离心法提取胰蛋白酶的专一性抑制剂-鸡卵类粘蛋白（CHOM）作为亲和配基，运用了 Bradford 法定量测定蛋白质浓度再利用亲和层析法对胰蛋白酶进行分离纯化，然后通过用抑制剂对酶反应速度的影响来了解酶促反应，掌握其规律，为了最大限度地实现酶促反应的高效率、寻找最有利的反应条件以及了解酶在代谢中的作用和某些药物的作用机理等，都需要掌握酶促反应速度的规律。最后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行酶纯度检验以及其相对分子量的测定。关键词：胰蛋白酶；鸡卵粘蛋白；亲和层析法；米氏常数；酶促反应动力；聚丙烯酰胺凝胶电泳北京理工大学珠海学院实验论文IITrypsin of isolation and purification and dynamic researchAbstractThis experiment through with organic solvent precipitation method and centrifugal method extraction trypsin of specific sex inhibitors-chicken eggs class stick protein (CHOM) as Affinity distribution base, using has Bradford method quantitative determination protein concentration again using affinity chromatography method on trypsin for separation purification, then through with inhibitors on enzyme reaction speed of effect to understand enzyme promoting reaction, master its law, to maximum to achieved enzyme promoting reaction of efficient, and To find the most favorable conditions and the role of the enzyme in the metabolic mechanism and effect of certain drugs, needs to master the law of speed of enzymatic reactions. Finally, polyacrylamide gel electrophoresis of enzyme purity test and the determination of its molecular weight.Key words: trypsin; egg protein; affinity chromatography;-Menten constant; enzymatic reaction force; Polyacrylamide gel electrophoresis北京理工大学珠海学院实验论文III目录摘要 .IAbstract .II目录 .III1 前言 .11.1 研究背景 .11.2 胰蛋白酶简要介绍 .11.3 蛋白分离纯化方法综述 .11.3.1 沉淀法 .11.3.1.1 盐析法 .11.3.1.2 有机溶剂沉淀法 .21.3.1.3 蛋白质沉淀剂 .21.3.1.4 聚乙二醇沉淀作用 .21.3.1.5 选择性沉淀法 .21.3.2 吸附层析 .21.3.2.1 吸附柱层析 .21.3.2.2 薄层层析 .2北京理工大学珠海学院实验论文IV1.3.2.3 聚酰胺薄膜层析 .21.3.3 离子交换层析 .31.3.4 凝胶过滤 .31.3.5 亲和层析 .31.3.6 聚焦层析 .41.3.7 气相色谱 .41.3.8 高效液相色谱 .41.4 胰蛋白酶研究进展 .42 实验原理 .52.1 胰蛋白酶的亲和配基-鸡卵粘蛋白的分离与定量 .52.1.1 蛋白质沉淀 .52.1.1.1 盐析 .52.1.2 蛋白质定量 .52.2 亲和层析法分离纯化胰蛋白酶 .52.2.1 亲和层析法的各项要素 .52.2.2 亲和层析法介绍 .62.2.3 胰蛋白酶活性测定 .62.3 酶动力学研究 .72.3.1 米氏方程 .72.3.2 抑制动力学 .72.4 聚丙烯酰氨凝胶电泳 .82.4.1 PAGE 凝胶的组成 .82.4.2 电泳的浓缩作用 .82.4.3 PAGE 染色及干燥 .8北京理工大学珠海学院实验论文V3 实验材料（设备） .93.1 实验材料 .93.1.1 实验原料 .93.1.2 实验原料来源 .93.1.3 凝胶配置 .93.1.3.1 Disc-PAGE/SDS-PAGE 分离胶（T=12%,C=3%）配方 .93.1.3.2 Disc-PAGE/SDS-PAGE 浓缩胶（T=5%Acrylamide,C=3%）配方 .103.1.4.实验试剂 .103.1.5 实验主要设备与仪器 .104 实验方法 .114.1 实验流程示意图 .114.2 胰蛋白酶的亲和配基-鸡卵粘蛋白的分离与定量 .124.2.1 有机溶剂沉淀法 .124.2.2 TCA 沉淀法 .124.2.3 高速离心法 .134.2.1 蛋白质盐脱 .134.2.1 Bradford 法定量蛋白质 .134.3 亲和层析法分离纯化胰蛋白酶 .134.3.1 N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（ BAEE）法 .134.4 酶动力学研究 .144.4.1 双倒数作图法(Lineweaver-Burk)测定 Km.144.5 聚丙烯酰氨凝胶电泳 .144.5.1 蛋白质相对分子量的测定 .145 实验结果与分析讨论 .15北京理工大学珠海学院实验论文VI5.1 胰蛋白酶的亲和配基-鸡卵粘蛋白的分离与定量 .155.2 亲和层析法分离纯化胰蛋白酶 .165.3 酶动力学研究 .185.4 聚丙烯酰氨凝胶电泳 .197 结论 .21参考文献 .22附录 .23北京理工大学珠海学院实验论文11 前言1.1 研究背景蛋白质分离纯化是用生物工程下游技术从混合物之当中分离纯化出所需要得目的蛋白质的方法。是当代生物产业当中的核心技术。该技术难度、成本均高。 1蛋白质在细胞和生物体的生命活动过程中（包括催化代谢反 应、 物质运转、兴奋的传导、生长发育的控制等）起着重要的作用，因此，蛋白质是生命科学极为重要的研究对象。蛋白质的分离纯化是蛋白质研究中不可缺少的环节，只有了解蛋白质的分子量、溶解性、等电点以及稳定性等基本性质，才能达到有效分离。 2酶促反应动力学（kinetics enzyme-catalyzed reactions）主要研究各种理化因素对酶促反应速度的影响。在酶的结构与功能关系以及酶作用机理的研究中，需要动力学研究提供实验证据。为了最大限度地实现酶促反应的高效率、寻找最有利的反应条件以及了解酶在代谢中的作用和某些药物的作用机理等，都需要掌握酶促反应速度的规律。因此，酶促反应动力学是酶学研究中的一个既具有重要理论意又具有实践意义的课题。影响酶促反应速度的因素主要有底物的浓度、酶的浓度、温度、pH 值、酶的激活剂及抑制剂等。1.2 胰蛋白酶简要介绍胰蛋白酶 Trypsin (Parenzyme) 为蛋白酶的一种，EC 3.4.4.4，是从牛、羊、猪的胰脏提取的一种丝氨酸蛋白水解酶。在脊椎动物中，作为消化酶而起作用。在胰脏是作为酶的前体胰蛋白酶原而被合成的。作为胰液的成分而分泌，受肠激酶，或胰蛋白酶的限制分解成为活化胰蛋白酶，是肽链内切酶，它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残