果蝇精巢fasⅢ基因原核表达载体的构建毕业论文

1果蝇精巢 fas基因原核表达载体的构建费紫薇，生命科学学院摘 要：果蝇 fas基因是蛋白编码类基因，在精巢中 fas基因主要在 hub cell 中表达，本实验运用基因克隆技术，以 PET28a 质粒为载体，选用BamHI、Hind 两种酶做双酶切，将目的基因 fas导入质粒载体 PET28a，从而构建原核表达载体 PET28a-fas，再将重组质粒转化到大肠杆菌 TOP10 中，实现 fas基因的原核表达。实验所用质粒载体用卡那抗性（Kan r ）标记，只有转化成功的大肠杆菌才能在涂有卡那霉素的 LB 培养基中生长。最终目的是实现 fas蛋白的原核表达与纯化，为以后制备多克隆抗体奠定基础。关键词：基因克隆；fas基因；原核表达载体；原核表达；The construction of fas III prokaryotic expression vectors ziweiFei，College of life scienceAbstract: Drosophila Fas gene is protein coding gene in testis, mainly expressed in hub cell. In this experiment, by means of gene cloning technique, the target gene FasIII was inserted into the plasmid vector PET28a which was digested by two enzymes of BamHI and Hind . so as to construct the prokaryotic expression vector PET28a-fas, then the recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli TOP10, achieve Fas III gene prokaryotic expression. The plasmid vector was marked with kanamycin resistant (Kanr) , Only was transformed successfully Escherichia coli can grow in LB medium which was coated with kanamycin. The ultimate aim is to realize the prokaryotic expression and purification of Fas III protein, for the future lay the foundation for preparing polyclonal antibody.Key words: Gene cloning；fas ；the prokaryotic expression vector；prokaryotic expression；21前言1.1 果蝇精巢的基本特征有两个精巢，形状为长而卷曲状的管状，图示 1-2 3显示出了精巢前端的结构。精巢里有两类干细胞:生殖干细胞 GSC 和体节干细胞 SSC。GSC 有 7-9个，位于精巢的顶端，与 Hub cell（HC）直接接触，HC 是精巢 GSC 微环境的重要组成部分 4，SSC 包裹在 GSC 周围，和 HC 共同构成了 GSC 的“niche” 5。同卵巢 GSCs 一样 ,精巢的 GSCs 也通过不对称分裂产生 2 个子代细胞，一个仍然处于微环境中，与 HC 直接接触，成为新的 GSC，另一个远离微环境，发育为 GB（ gonialblast）细胞，走向分化。GB 细胞经四次胞质不完全分裂形成一个 16cell 相连的合胞体。 Fusome 在 GB 中是圆形的，在分化的合胞体呈分支状。每个 GB 或合胞体都被两个 SCCs 围绕着，持续调控它们的分化。图 1-2 精巢前端的结构Fig.1-2 The leading-end structure of tesis1.2 fas基因干细胞研究是目前国际研究前沿的热点之一，生殖干细胞 GSC 的研究对于干细胞维持与分化等领域，以及生殖医学及其相关疾病等的治疗都将提供有价值的资料。果蝇具有繁殖周期短、结构相对简单、拥有成熟的遗传分析手段及丰富的遗传学资源等特点；同时鉴于果蝇生殖干细胞分裂和分化发育过程中的细胞谱系都研究得很清楚，故果蝇的精巢和卵巢是细胞和分子水平上研究干细胞生物学的理想系统。fas基因是蛋白编码类基因，具有七个转录本，最早发现于神经细胞中，功能是以 Ca2 +独立的方式介导细胞粘附，在轴突发展、指导和束状的神经系统的发展发挥作用。 果蝇精巢中 fas基因主要在 hub cell 中表达 1，利用 fasIII 基因的表3达蛋白制备多克隆抗体，进行抗原抗体免疫荧光反应，可以确定 Hub 细胞的位置 2，从而有利于对果蝇精巢干细胞的研究。1.3 载体 （Vectors）广义上通常把能携带外源基因进入受体细胞的运载工具叫载体。在基因工程操作中，把能携带外源 DNA 进入受体细胞的 DNA 分子叫载体 6。1、基因工程对载体的要求：（1）具有对受体细胞的可转移性，可提高载体导入受体细胞的效率。（2）具有与特定受体细胞相适应的复制原点或整合位点，使得外源基因可在受体细胞中大量繁殖或稳定遗传。（3）具有多种单一的核酸酶切位点(多克隆位点)，可用于外源基因的插入，同时不影响载体的扩增和繁殖。（4）具有合适的选择标记，便于重组 DNA 分子的检测。（5）具有较好的安全性，不能任意转移，避免基因的非控制性扩散，给人类造成危害。本实验选用的 PET28a 为质粒载体，长度为 5369bp 。1.4 抗菌素的抗性工作原理卡那霉素（kanamycin，Kan）杀菌原理：通过与 70S 核糖体结合，导致 mRNA 发生错读。杀死细菌。细菌抗性原理：Kan r 编码的氨基糖苷磷酸转移酶，对卡那霉素进行修饰，阻断其与核糖体结合作用。2 实验材料与方法2.1实验材料2.1.1 实验仪器表 2.1 实验仪器及厂家Table 2.1 Experimental instruments and manufacturers仪器名称 name of apparatus 生产厂家 manufacturers恒温水浴锅 HH-2 江苏金坛市宏华仪器厂双人单面净化工作台 SW-CJ-2FD 苏州净化设备有限公司高速冷冻离心机 EppendorfDNA 扩增仪 Lcycler电热恒温培养箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂4气浴恒温振荡器 SH2-82A 金坛市宏华仪器厂智能电热鼓风干燥箱 上海成顺仪器仪表有限公司2.1.2实验试剂限制性核酸内切酶：BamHI Hind10K Buffer 通用 BufferBSAprimerSTAR MAX premixcDNA 模板CIAP 碱性磷酸酶琼脂糖1TAE 缓冲液溴化乙锭溶液 EBDNA 分子量 Marker15kb10loading buffer5M Nacl苯酚、氯仿无水乙醇75%乙醇溶液T4 DNA 连接酶10T4 DNA ligase bufferInoue 转化缓冲液DMSO 二甲亚矾LB 液体培养基试剂盒：琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒离心柱型质粒小提试剂盒（离心柱型）2.1.3引物本实验所用的扩增引物和测序序列均由生工生物工程上海有限公司合成部合成。引物片段：Fas-bamH/F： ataggatccCTCCTCAACGAAGGCATCGFas-Hind/R： ataaagcttctaGAGGCTGCTGCTGGGCGGTTTG2.1.4质粒载体本实验所用质粒载体 PET28a 来自于本实验室保存。52.2实验方法2.2.1目的基因的获取1、PCR 反应体系表 2.1 PCR 反应体系 150lTable 2.1 PCR reaction system(150l)反应组分 体积2primer STAR MAX premix 75.0l上游引物 fas-bamH/F 1.5l下游引物 fas-Hind/R 1.5lcDNA 模板 6.0lddH2O 66.0l2、PCR 反应程序98 5min98 20s30 cycles 55 20s72 1min30s72 5min16 4min3、琼脂糖凝胶电泳检测（1）制备 0.1琼脂糖凝胶：称取 0.25g 琼脂糖，加入 25ml1TAE 缓冲液，置微波炉加热至完全融化，取出摇匀。（2）胶板的制备：1）将塑料内槽洗净、晾干，放置于水平制胶器中，并放好样品梳；2）待胶液冷到 60左右时，加入 23l 的溴化乙锭，轻轻混匀后将胶液倒6入塑料内槽，至塑料板上形成一层胶面；3）待胶液凝固后，将梳子轻轻垂直拔出；4）将塑料内槽取出放入电泳槽内，并加入 1TAE 缓冲液至电泳槽中使缓冲液浸没胶面，高出凝胶。（3）加样：取约 2l10loading buffer 与 2l PCR 产物混合均匀，用移液枪加到凝胶孔中，并用 DL15000TM DNA Maker 做对照。（4）电泳：盖好电泳槽盖子，接通电泳槽与电泳仪的电源，选择电泳电压120V，开始电泳。（5）观察结果：取出样品，在紫外灯下观察，摄像，根据片段大小判断目的片段是否扩增成功。2.2.2 酶切1、DNA 产物的纯化产物共 150L，集中到 1.5mL EP 管，加无菌水至 500L（1）酚抽：在 EP 管中加入等体积，即 500L 苯酚/氯仿混合液，颠倒混匀，室温 12000r/min 离心 5min，吸取上层液到新的 EP 管，吸约 450L（2）加入 1/10 体积的 5M NaCl（按 450uL 换算，即 45L NaCl）（3）加入 2-3 倍体积无水乙醇 1mL，混匀，412000r/min 离心 10min，吸走上清液，产物沉淀在底部。（4）漂洗：用 70%乙醇清洗沉淀 1-2 次，离心，彻底吸走上清液。（5）干燥和溶解：自然干燥 5min 至残留乙醇挥发干净，加入 20L 无菌水溶解。2、酶切，体系如表 2.2 所示表 2.2 酶切体系 50lTable 2.2 Enzyme digestion system(50l)反应组分 体积无菌水 18.0lBSA 5.0l10K.Buffer 5.0lBamHI 1.0lHind 1.0l质粒或片段 20.0l溶液配好混匀后瞬时离心，使溶液集中于管底，放在 37 水浴锅水浴 1h；其中 PET28a 质粒酶切管在水浴 1h 后需加入 1lCIAP，接着水浴 30min。2.2.3琼脂糖凝胶电泳法回收 DNA71、制胶2、切胶3、琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒操作步骤（1）柱平衡步骤：向吸附柱 CA2 中加入 500l 平衡液 BL，12000rpm 离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（2）将单一的目的 DNA 条带从琼脂糖凝胶中切下，放入干净的离心管中，称取重量。（3）向胶块中加入 3 倍体积溶胶液 PN，50水浴放置 10min，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。（4）将上一步所得的溶液加入一个吸附柱 CA2 中，室温放置 2min，12000rpm离心 30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱 CA2 放入收集管中。（5）将吸附柱 CA2 中加入 600l 漂洗液 PW，12000rpm 离心 30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱 CA2 放入收集管中。（6）重复操作步骤 5（7）将吸附柱 CA2 放入收集管中，12000rpm 离心 2min，尽量除尽漂洗液。将吸附柱 CA2 置于室温放置数分钟，彻底晾干。（8）将吸附柱 CA2 放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液 EB，室温放置 2min。12000rpm 离心 2min 收集 DNA 溶液。（9）电泳检测：分别取 3l 酶切样品与 2l 10loading buffer 混合后加到凝胶孔中开始电泳，电泳结束后取出样品，在紫外灯下观察，摄像。2.2.4 DNA片段的体外连接(目的基因导入质粒载体)1、配制连接体系，各成分如表 2.3 所示，体系中外源基因量要多些，载体的量要少些；表 2.3 连接体系 10lTable 2.2 Connection system(10l)反应组分 体积10T4 DNA ligase Buffer 1.0lT4 DNA ligase 0.8l酶切的 PET28a 质粒 3.0l酶切的 fas 片段 5.2l2、混匀后用瞬时离心，使液体全部集中于管底；3、将离心管放于 16 水浴锅保温过夜；4、取出连接体系，利用感受态细胞进行转化实验。82.2.5连接体系的转化1、取 1 管 100l 的 TOP10 超级感受态细胞，在冰上化冻后，在无菌操作台里向 EP 管中加入 7l 连接体系，用枪轻轻吹打混匀；2、将 EP 管插在冰水复合物中冰浴 30min；3、将 EP 管放到 42恒温水浴锅中保温 90s，然后迅速放到冰水复合物中冰浴2min；4、在无菌操作台里向 EP 管中加入 1ml 的含 K 的液体 LB 培养液，混匀后放于摇床上 37振荡培养 45min，转速为 150rpm/min，使细胞恢复正常生长状态；5、45min 之后，3000r/min 离心 3min6、在无菌操作台中弃去 950l 上清液，余下的 150l 用移液枪轻轻打匀，吸至含 K 的 LB 培养基平板中，用事先已经加热灭菌并冷却后的三角推棒轻轻涂布均匀；7、待涂布液干燥后，将平板 37培养箱中倒置过夜培养。2.2.6挑菌落做菌落 PCR1、PCR 反应体系表 2.4 PCR 反应体系 25lTable 2.4 PCR reaction system(25l)反应组分 体积10PCR Buffer 2.5ldNTP 0.25l上游引物 fas-bamH/F 0.25l下游引物 fas-Hind/R 0.25lrTaq 酶 0.25l模板ddH2O 21.5l模板：阳性对照重组质粒的连接体系阴性对照无菌水实验组待检测的菌落2、PCR 反应程序97 3min94 30s930 cycles 52 30s72 1min72 3min16 3min3、琼脂糖凝胶电泳检测：以 DNA Mamker 和阳性对照作参考，判断实验组条带大小是否正确，进而判断是否为阳性克隆。2.2.7重组质粒的转管培养1、经过菌落 PCR 鉴定后，挑选 4 个初步鉴定是阳性克隆的菌落转管培养。2、将无菌操作台灭菌后，取 4 个 15mlEP 管，分别加入约 4ml 含卡那霉素（Kan）的 LB 液体培养基。3、用无菌枪头挑取单菌落，在 EP 管的培养基中轻轻搅拌，并将枪头打入 EP管中，盖紧管盖，放于摇床上 37振荡培养过夜，转速为 180rpm/min。2.2.8 PET28a-fas质粒的少量制备1、菌液保种：将选取的菌液扩大培养，浑浊后分别取 450l 菌液并各加入50lDMSO 于-20冻存。2、用质粒小提试剂盒（离心柱型）提取并制备质粒。操作步骤：（1）柱平衡步骤：向吸附柱 CP3 中加入 500l 平衡液 BL，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（2）取 1.5ml 过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12000rpm 离心 1min，尽量吸除上清。（3）向留有菌体沉淀的离心管中加入 250l 溶液 P1（使用前已加入 RNaseA）,用移液枪彻底悬浮细菌沉淀。（4）向离心管中加入 250l 溶液 P2，温和地上下翻转 6-8 次使菌体充分裂解，所用时间不超过 5 分钟。（5）向离心管中加入 350l 溶液 P3，立即温和地上下翻转 6-8 次，充分混匀，将出现白色絮状沉淀。12000rpm 离心 10min。（6）将上一