杨蕊+基于丁香天蛾全线粒基因组的分子进化研究最终VIP

2017届学士学位论文基于丁香天全线粒基因组的分子进化研究学院、 专 业 生命科学学院 生物科学 研 究 方 向 动物分子进化 学 生 姓 名 杨蕊 学 号 20131501069 指导教师姓名 李艳 指导教师职称 副教授 2017 年 5 月 20 日淮北淮北师范大学本科生毕业论文（设计）诚信承诺书本人郑重承诺所呈交的毕业论文（设计）基于丁香天全线粒基因组的分子进化研究，是在指导教师 李艳 的指导下严格按照学校和学院有关规定完成的。本人在毕业论文（设计）中引用他人的观点和参考资料均加以注释和说明。本人承诺在毕业论文（设计）选题和研究过程中没有抄袭他人的研究成果和伪造相关数据等行为，若有抄袭行为，由本人承担一切责任。承诺人： 年级 专业签 名：2017 年 5 月 20 日基于丁香天蛾全线粒基因组的分子进化研究杨蕊（淮北师范大学生命科学学院）（指导教师：李艳）摘要 丁香天蛾（ Psilogramma increta） 是节肢动物门（ Arthropoda）、六足亚门（Hexapoda）、昆虫纲（Insecta）、有翅亚纲（Pterygota)、鳞翅目（Lepidoptera)、天蛾科（Sphingidae）的昆虫。本研究通过设计磷翅目线粒体简并引物，然后再用 PCR 法克隆丁香天蛾全线粒体组序列，在 GenBank 数据库中通过比对获得亲缘关系相近的同源物种的全线粒体组序列。然后用 ClustalX2.0 和 MEGA 6.06 软件运用邻接法(Neighbor-Joining 法)构建系统进化树，对丁香天蛾进行分子进化分析。结果表明，丁香天蛾全线粒体组序列全长 15254 bp，它共有 13 个编码蛋白质的基因，22 个转运 RNA，2 个核糖 RNA 和一个A-富集区；系统进化树分析结果表明丁香天蛾与天蛾科的昆虫亲缘关系较近，先聚成一支，再与其他科的样品汇聚成大支。关键词：丁香天蛾；CO；鳞翅目；分子进化The study of molecular evolution across the genome based on particle clove SphinxYang rui(School of life sciences, Huaibei Normal University)(Instructor:Li Yan)Abstract Psilogramma increta is a kind of insecta of Athropod Hexapoda Insecta Pterygota Lepidoptera and Sphingidae.This study was designed for the mitochondrial degenerate primer of Phosphorus spectacle and then the PCR method is used to clone the complete mitochondrial sequences of Psilogramma increta. We could obtain a complete mitochondrial sequence of closely related homologous species by comparison in the GenBank database .The ClustalX2.0 and MEGA 6.06 software were used to constructed Neighbor-Joining in order to analysis Psilogramma increta of molecular evolution .The results showed that the full-length sequence of mitochondrial Psilogramma increta is 15254bp. And it has 13 genes encoding proteins, 22 transporters RNA, 2 ribose RNA and one A- enrichment zone. phylogenetic tree analysis showed that the more recent clove Sphingidae insects and Psilogramma increta genetic relationship,they clustered into one group first and than other samples gathered into branches.Keywords: clove menephore; CO 1; Lepidoptera; molecular evolution目录引言 .11. 材料与方法 .11.1 动物来源 .11.2 实验仪器 .11.3 丁香天蛾总 DNA 提取 .11.4 PCR 扩增 .11.5 PCR 产物电泳检测与测序 .21.6 全线粒组基因序列分析 .22. 结果 .23.讨论 .4参考文献 .5致谢 .6基于丁香天蛾全线粒基因组的分子进化研究0引言丁香天蛾（ Psilogramma increta）， 是节肢动物门（ Arthropoda）、六足亚门（Hexapoda）、昆虫纲（Insecta）、有翅亚纲（Pterygota)、鳞翅目（Lepidoptera)、天蛾科 Sphingidae、面形天蛾亚科、霜天蛾属。天蛾科是鳞翅目中一个较大的类群。其头部为黑褐色，胸部和背为棕色，黑色纵线呈现于肩板两侧，后缘有 1 对黑斑，黑斑内侧前上方有白点，下方条形白斑。在中国湖南、浙江、福建等地都能够搜寻到它的身影。它的幼虫主要寄生在丁香, 梧桐, 女贞树上面 2，丁香天蛾的双翅展开约长 10.7-12.6cm，身体长度约 3.2-3.7cm.腹部背面中央为黑色，两侧有棕黑纵带；胸腹部腹面呈白色。灰白的前翅，并且各横线不突出，由于中室端长有灰黄色小斑点，有颇厚灰色鳞片长在斑点四周，这样就形成不规则短横带，在前翅的顶角的内侧有黑色的线条弯曲的向前延伸到达丁香天蛾的前沿，而后翅是棕黑色的，在其外缘有白色的呈现一段一段的短线，后角内部有 2 块椭圆形的灰白色的斑块。丁香天蛾的分类鉴定对环境调查、自然保护和分类学钻研来说是非常重要的。目前，丁香天蛾鉴定的方式大多采用传统外形生态分类 1。丁香天蛾具有较高的形态多样性，如果仅靠形态特征，对其精确鉴定，这是难以做到的 1-3。而精确的物种鉴定是人类认知大自然和可持续发展的不可缺少的前提，对于科学发展的巨大需求来说，形态学特征鉴定物种很难再满足了。PCR 技术的出现、发展与完善，涌现出一系列分子生物学技术，这些新技术在生物物种鉴定方面起到了很大的作用，很大程度上弥补了传统形态学鉴定的弊端 4-6。本研究是利用 PCR 技术克隆磷翅目昆虫丁香天蛾的全线粒体基因组对丁香天蛾及其它磷翅目间的分子进化关系进行研究。1. 材料与方法1.1 动物来源本实验中所涉及到的丁香天蛾捕自安徽省淮北市淮北师范大学校园内（1164834E，33591N），-20保存备用。1.2 实验仪器超高速离心机（Eppendorf5417R）、恒温摇床（上海世平 SPH-200B）、PCR 仪、超微量分光光度计（Thermoscientific）、蒸汽灭菌锅（上海颐鹏）、恒温混匀振荡器（Eppendorf）、电泳仪（北京六一）、凝胶成像系统（Alpha Innotech）、紫外透射仪、超净工作台（上海苏净）、数显电热恒温培养箱（上海博迅）、迷你离心机（长沙湘仪）、电泳槽（北京六一）、数显恒温水浴锅（上海海能)、电子天平（上海恒平）。1.3 丁香天蛾总 DNA 提取基于丁香天蛾全线粒基因组的分子进化研究1使用 QIAGEN（No.56304）基因组抽提试剂盒提取丁香天蛾总 DNA，操作如下：基于丁香天蛾全线粒基因组的分子进化研究00（1）取从校园中扑捉到的丁香天蚕的组织少许放入到研钵之中，然后再往研钵中加入液氮，液氮和丁香天蚕组织充分研磨至浆糊状将，然后每 10mg 组织加入 180L ATL Buffer，平衡至室温。（2）往上述的研磨好的组织中加入 20Lproteinase K ，均匀的振荡 15s，在56的恒温箱中孵育 3h。（3）加入 200L AL Buffer，均匀的振荡 15s；（4）然后再向上述溶液中加 200L 无水乙醇，振荡 15s，使之均匀的混合，然后放在室温下静置 5min，要快速的拿离。（5）将以上液体转移到 QIAamp MinElute 柱，8000 rpm 离心 1 min，倒去上清液，然后再向弃去上清液的底物中加 500 L AW1 Buffer，再在 8000 rpm 的离心机中离心 1 min，移除离心管，倒去上清液。（6）往上述弃去上清液的离心管中加入 500L AW2 Buffer， 再 8000 rpm 离心 1 min，同样的弃去上清液；然后再 14000 rpm 离心 3 min；弃去上清液。（7）往上述离心管中加入 60 L Buffer AE，先在室温下静置 5min，然后 14000 rpm 离心 1 min；最后用 Nano 2000c 测定其浓度。1.4 PCR 扩增PCR 扩增的原理：PCR 扩增技术是模仿的体内 DNA 的复制，是以想要扩增的 DNA片段为模板，以一段与两条 DNA 核苷酸链分别互补的核苷酸链为引物，利用 4 种脱氧核糖核苷酸为原料，在 DNA 聚合酶的作用下，按照半保留复制的原理，在体外大量扩增目的 DNA 的技术。便于肉眼的观察以及检测。PCR 的扩增一般有三个循环的反应：高温变性-低温退火（变性）-延伸三个部分组成。PCR 扩增的第一部是获得目的基因：根据磷翅目线粒体组基因序列的特点，设计特异性引物扩增丁香天蛾全线粒体组基因序列，引物这都是由上海生工公司合成。Taq 酶也购自上海生工公司，PCR 反应体系（20L）为：Template 0.5L，引物 1 0.8L，引物 2 0.8L，10PCR Buffer(Mg2+ free) 2L，25mM MgCl2 1.2L，2.5mM 4dNTP Mixture 1.6L，Taq 酶 0.4L，ddH2O 12.7L。PCR 反应程序：（1）目的基因变性：把模板 DNA 升温至 94保留 5min，使目的基因的双链解开成为单条的 DNA 单链，有利于和引物的结合。（2）目的基因与引物的退火：经过上述的高温之后，双链的 DNA 解螺旋成为了单链的 DNA,然后把温度调至 4515s，72 2min, 这样引物就可以根据碱基互补配对的原则和目的基因结合。这里面的引物相当于 DNA 复制时的冈绮片段，可以为以下的核苷酸的合成指引方向。（3）引物的延伸：DNA 与引物结合之后形成二聚体，在 DNA 聚合酶的作用下，以 4种脱氧核糖核苷酸为原料，目的基因为模板，按照半保留复制的原则合成新的 DNA基于丁香天蛾全线粒基因组的分子进化研究11片段，新合成的与双链的目的基因一样。就这样在 72的条件下循环 30 次，每一次循环的时间是 5min7。1.5 PCR 产物电泳检测与测序取按照上述 PCR 扩增技术获得的目的基因的产物 3L ，使之与 1L 6Loading Buffer 充分的混合，然后用 1% 琼脂糖凝胶在 120V 的条件下电泳 20分钟，根据电泳的情况检测 PCR 产物。然后送往上海生工公司测序。根据测序结果进行丁香天蛾全线粒体 DNA 序列的分析，以及亲缘关系的鉴定。1.6 全线粒组基因序列分析 本实验测序的结果使用 Lasergene 软件中的 Seqman 程序进行拼接，等到取得丁香天蛾的全线粒组基因的全长之后，在 GenBank 的核酸数据库中将拼接后的结果进行同源性比较。所得到的同源序列用 CalustalX 2.0 进行比对，最后用 MEGA 6.06 软件运用 NJ（Neighbor-joining）法构建系统进化树，Bootstrap method 1000 次验证。2. 结果经过测序分析，得到丁香天蛾全线粒体组序列全长为 15254 bp，其中共有 13个可以编码蛋白质的基因，22 个转运 RNA（tRNA），只有 2 个核糖 RNA（rRNA）和一个 A-富集区；使用 MEGA 6.06 软件，采用 Bootstrap 重复抽样检验 1000 次进行 NJ（Neighbor-JoiningNJ）系统进化树的构建。从图中可以看出，各个样品先按照系统进化关系的远近聚成一支：丁香天蛾先与大背天蛾聚成一支，再与烟草天蛾和 Sphinx morio 聚成天蛾科支；天蛾科再先后与天蚕蛾科、桦蛾科和蚕蛾科汇聚成一大支，即蚕蛾总科。根据这个结果可以看出丁香天蛾与大背天蛾进化关系较近，与烟草天蛾和 Sphinx morio 的关系次之，与天蚕蛾科，桦蛾科以及蛾科的关系比较远。基于丁香天蛾全线粒基因组的分子进化研究22图 1 全线粒体组系统进化树Figure 1 Neighbor-joining tree based on complete mitochondrial genome sequences注： AB070263 Bombyx mandarina， KC881286 Rondotia menciana， KP216766 Bombyx huttoni vo