桔梗提取工艺及质量控制的研究进展

安徽大学细胞生物学精品课程 1国家级大学生创新性实验项目论文选登之一 桔梗提取工艺及质量控制的研究进展 陈 尘，陈 勤* （安徽大学生命科学院，安徽省中药研究与开发重点实验室，安徽 合肥 230039） 摘要：总结了近年来对桔梗活性成分提取和鉴定的研究成果，简述了桔梗中有效成分桔梗皂苷的提取工艺方法和质量控制的几种途径，比较了各种方法间的优劣和适用范围，为进一步的研究提供了依据。 关键词：桔梗；活性成分；提取工艺；质量控制 Research Advances in Extraction Process and Quality Control of Platycodon grandiflorum A.DC CHEN Chen， CHEN Qin (School of life Science,Anhui University, Anhui Key Laboratory of Chinese Medicine Research and Development,Hefei 230039) Abstract This paper research on extraction and identification of active ingredient in the Platycodon grandiflorum, and briefs the several methods of extraction process and quality control, and compared with each methods advantages and properly applicable ranges based on the recent research results. Keywords Platycodon grandiflorum; active ingredient; extraction process; quality control桔梗为桔梗科植物桔梗Platycodon grandiflorum (Jacq.) A. DC.的干燥根1，是我国常用中药之一，其种植区域广泛，尤以华东地区为好。据本草纲目记载，桔梗又名白药、梗草，味辛、微温、有小毒。主治胸满不痛、伤寒腹胀、咳嗽喘急、肺痈咳嗽等症。现代研究表明，桔梗及其有效成分具有抗炎、镇静、降血糖、降血脂、抗胆碱、抗肿瘤及免疫调节活性、促进胆酸进行分泌、抗过敏等多种药理作用2。据临床报道3，桔梗在治疗咳嗽、支气管炎、咽喉炎等病症时有显著疗效，有效率均达95%以上。迄今为止，国内外学者已从桔 收稿日期： 基金项目：国家大学生创新性实验项目（NO. 081035701） 通讯作者：陈 勤(1958 )，男，安徽当涂人，教授，博士，研究方向：细胞信号转导与药物基础研究。安徽大学细胞生物学精品课程 2E-mail:  梗中分离出了诸如桔梗皂苷D、桔梗皂苷A、桔梗皂苷B等近40种单体4，其中桔梗皂苷（platycodin）是桔梗中含量相对较高和主要活性成分之一。目前有关桔梗皂苷的提取分离与质量控制等方面的研究受到了人们的广泛关注，本文综述了桔梗皂苷的提取工艺和质量控制的研究进展，旨在为桔梗提取物的深入研究提供参考。 1 提取工艺研究 1.1 回流法1   春、秋采挖桔梗，洗净、去根须，干燥制粉。 取1 g加入7%硫酸乙醇-水（1：3）混合溶液20 ml，加热回流3 h，冷却，再用三氯甲烷提取，每次20 ml，合并提取液，用30 ml水洗涤后弃去洗液。三氯甲烷用无水硫酸钠脱水，过滤，蒸干滤液，残留物加甲醇溶解，待用即可。此为药典提供的主要用于鉴定的方法，提取量小且过程相对复杂，不适合大规模工业生产。 1.2 水提法 水是最方便易得廉价的提取剂，用水提取桔梗中的桔梗皂苷能大大缩小提取成本。水提法中包括冷浸法、热提法和超声-水提法三种常用提取方法。 1.2.1 冷浸法5 取8 g桔梗粉末，加入50 ml蒸馏水，振荡摇匀，在室温下静置1.5 h，过滤、取滤液。将滤液置于蒸 馏瓶中对水回收，终得到深褐色的粘稠液体，放在105 下干燥至恒重，即得桔梗皂苷粗品。称重后得总皂苷平均0.37 g，含量为4.22 %。本法操作简单、方便易行，所得总皂苷含量较高，但杂质较多。 1.2.2 热提法5取8 g桔梗粉末，加入50 ml蒸馏水，振荡摇匀，在50 水浴锅中静置1.5 h，过滤、取滤液。后续操作与冷浸法相同。称重后，总皂苷平均含量为0.44 g，占5.43 %。此方法较冷浸法得率高，且同样具有简单易行等优点，是一种不错的提取方法。 1.2.3 超声波-水提法6取桔梗粗粉5 g，加水50 ml，浸泡一段时间后在40 下超声处理30 min，过滤取滤液；将剩下的沉淀加水，同上处理，并将两次提取液合并。提取液置于旋转蒸发仪中浓缩至干，加20ml甲醇，加热溶解，冷却，取上清，加入50 ml乙醚，离心，弃上清，沉淀加甲醇，加热溶解、冷却、离心、取上清沉淀再次分别加入10 ml、5 ml甲醇，离心，收集上清，并合并三次所得上清液。将上清液浓缩至原体积的1/3，加入50 ml乙醇。同上操作。合并所有上清液，浓缩，移至恒重蒸发皿，在60 下烘干5 h，得0.21 g浅黄色粉末（为桔梗皂苷），产率为4.2 %，纯度为58.9 %。此法以水为提取剂，比传统的有机溶剂提取法节省成本，适于工业生产。另外，此法比传统的回流法节约时间。其次，此法产率较高。从产率安徽大学细胞生物学精品课程 3和效率上看，超声波-水提法比传统水提工艺更具优势。 1.3 醇提法5 取8 g桔梗粉末加入50 ml 95 %乙醇，振荡摇匀，室温下放置1.5 h，过滤提取液，取上清液，并将其放入旋转蒸发器上回收乙醇，得到深褐色粘稠液体，将其放入电热恒温箱中，在105 下干燥至恒重，所得即桔梗皂苷粗品。此法所得总皂苷含量为0.53 g，占6.42 %。此法的特点是操作简便快捷，所得粗品杂质少，纯度高。 另外，金锡久等人7介绍了桔梗另一种醇提法。方法是：取桔梗5 kg，洗净烘干，置于95 %乙醇中浸泡24 h，用4层纱布过滤，将滤液放在索氏提取器中在80 下回流3次，回收乙醇，将剩余物水浴加热，得膏状物，用于药物毒性的研究，但文献没有进一步做含量测定。孙军等人8在对桔梗提取工艺的研究中设计了不同的乙醇浓度、用量、提取次数和提取时间的正交试验，得出优化工艺：用浓度为70%的乙醇，用量为药材量的3倍，进行回流提取5次，每次1 h。 1.4 大孔树脂吸附分离法 1.4.1 乙醇浸泡提取-大孔吸附树脂柱色谱分离法9取过20目筛后桔梗干品适量，室温下用70%乙醇浸泡提取5次，每次36 h，每46h进行一次充分搅拌，将浸提物合并，浓缩直至油状物出现，在4 下放置48 h后分离油状物，用氯仿脱脂再用正丁醇萃取，取上层清液回收至干即可。同时浓缩提取液，也用氯仿脱脂后上ZTC-1大孔胶吸附树脂，分别用水、20 %、30 %、40 %、50 %、95 %的乙醇洗脱，将含皂苷的洗脱液浓缩至干，称重，求得平均得率为2.05%。该方法优点是工艺简单，得率高，成本低，适合工业生产。 1.4.2 水提-大孔吸附树脂柱色谱分离法10虽然乙醇浸泡提取-大孔吸附树脂柱色谱分离法效果较好，但提取周期较长，杨献文等对醇提大孔树脂方法进行了改进，探索出水提大孔树脂分离法。该法将桔梗干粉加8倍水回流提取0.5 h，后加6倍水回流提取2次，每次0.5 h，取滤液过大孔树脂柱，用水及不同浓度的乙醇洗脱，合并含皂苷的洗脱液并浓缩至加入95 %乙醇无沉淀为止，过滤，取滤液浓缩至干即得。结果平均得率为1.603 %。与水浸泡提法相比，此法快速省时，而且直接将提取液过大孔树脂进行富集，简化操作又降低能耗，适合于工业化大生产。虽然得率较低，但对桔梗药效的发挥无影响。 1.5 微波辅助萃取法11微波辅助萃取法是用MAS-1型常压微波辅助合成/萃取反应仪微波萃取装置对桔梗中的有效成分桔进行微波萃取的新方法。准确称取3 g桔梗粉末样品，置于长颈圆底烧瓶中，加入甲醇淹没样品。根据微波制样要求，设置实验参数，启动微波制样系统。反应结束后取出烧瓶，移出萃取液，将滤渣旋转蒸发至干，用24%的乙腈移出，待用。实验中以不用的桔梗、提取液质量比，甲醇体积分数，微波功率，微波辐射时间，样品粒径和萃取温度安徽大学细胞生物学精品课程 4为实验参数，探讨微波辅助萃取的最优条件。当m（桔梗）：m（提取液）=1：20，甲醇体积分数为20%，微波功率为600W，微波辐射时间为110s，样品粒径为80-100目，萃取温度为60时，桔梗皂苷D提取率达3.87mg/g。该法与超声提取和回流提取相比，具有桔梗用量少，溶剂体积小，提取时间短，提取次数少，提取率高等诸多优点，从而达到了提高工效、节省时间、提高提取率的目的。 1.6 超临界CO2萃取法12超临界萃取技术是一种高薪萃取技术，不但减少了有机溶剂的使用，同时还有萃取效率高、选择性高、省时清洁等多种优点。具体做法是：称取100 g桔梗粉末，置于萃取釜中，加入一定量的夹带剂，设定好萃取压力和温度，萃取完成后收集萃取液，测定产率。在夹带剂的选择上，作者在45 、30 MPa、萃取时间为4h的条件下用等量的无水乙醇、甲醇、正丁醇、丙酮、乙酸乙酯五种试剂作为夹带剂进行对比，综合比较得出无水乙醇为最佳选择。通过在不同萃取条件下的正交试验，得出最优的萃取条件为：萃取温度40、萃取压力35 MPa，萃取时间4 h，夹带剂用量为100 ml/100g。这种方法提取效率高，得率也较高，清洁易行，是现代分离工艺中常用的方法之一。该法已用于食用油的萃取，日后应在传统中药材提取方面大力推广。 2 质量控制方法研究 2.1 称重法1取桔梗粗粉约4g，精密称量，在索氏提取器中加入25 ml的甲醇，浸泡15 h后，再加25 ml甲醇，回流6 h，放置12 h以上后过滤，滤液浓缩至1520 ml，冷却，加乙醚50 ml振荡，静置至澄清，取沉淀分次加20 ml、10 ml、5 ml的甲醇并加热溶解，冷却，过滤，合并甲醇，浓缩至1520 ml，冷却，再加50 ml乙醚，同上处理一次，合并甲醇，至已恒重的蒸发皿中水浴蒸干，在105 下干燥至恒重，计算得率。本法操作繁琐，而且糖类等杂质不易去除，误差较大，现在已渐渐被其他方法代替。 2.2 比色法 杨壮等人4建立了以香草醛-高氯酸为显色剂，以桔梗皂苷D为对照品测定桔梗中总皂苷含量的比色法。该方法采用甲醇-超声波提取，并过AB-8型大孔吸附树脂再用正丁醇萃取制备供试溶液。测定时，吸取1 ml供试溶液于具塞试管中，在70 下水浴蒸干，后在60 下显色15 min，流水冷却10 min，加入冰醋酸5ml，用同法平行处理空白溶剂为对照，在475nm处测定吸光值，并比较标准曲线即可测得桔梗总皂苷的含量。该法在提取时采用大孔树脂与萃取结合的方法使得到的皂苷纯度高，杂质少，为比色法的测定排除干扰。并且该法精密度高，稳定性好，平均回收率为96.8 %，可用于药材质量评价。 李喜凤等人13探讨出的以桔梗皂苷D为对照，采用超声提取-香草醛-硫酸比色法测定桔梗中总皂苷的含量，结果平均加样回收率为99.22 %，RSD=1.8 %，是一种快速、准确的好方法。作者选择的香草醛-硫酸试剂反应稳定，桔梗皂苷D 作为标准品省去了脱脂除糖等安徽大学细胞生物学精品课程 5工序，且加样回收率高，与标准曲线可得良好线性关系（r=0.9997），较以总皂苷为标准品更方便、准确。具体操作是：以桔梗皂苷D标准品33 %甲醇溶液为标准溶液；样品的制备是用乙醚回流提取2 h后加入16倍量甲醇超声提取2次，每次30 min，合并滤液、浓缩，再用甲醇定容至25 ml即可。精密吸取样品溶液20 l于10 ml具塞试管中，热风挥发溶剂至干，精密加入0.5 ml10%香草醛试液和60%硫酸5 ml，摇匀，60 水浴加热15 min，冰水浴冷3 min，随行试剂做空白，于478 nm处测吸收值，并于标准曲线比较，即可知样品溶液中的桔梗皂苷含量。此法快速简便，便于对桔梗药材进行质量评价。 2.3 高效液相色谱法 2001年，朱丹妮等人14首次采用高效液相-蒸发光散射检测器色谱法测定桔梗中皂苷D 的含量。本法采用甲醇超声法提取制备桔梗皂苷供试品。精密称取桔梗皂苷D对照品1.2mg置于10ml容量瓶中用甲醇稀释后待用。精密吸取对照液和供试液20l，按色谱条件测定峰面积，峰面积及浓度取自然对数后用标准曲线计算桔梗皂苷D含量。色谱条件为色谱柱为C18柱（5l，4.6 mm250 mm）；流动相：乙腈：水=28：72；流速0.7 ml/min；柱温：室温。在此条件下测定峰面积，计算回归方程在0.32.4 g，r=0.9991，线性关系良好。加样回收率为99.57 %。该法具有精确度高，步骤简单，重复性好的特点。 石俊英等15应用高效液相法对不同产地的桔梗中桔梗皂苷D的含量进行了测定。用甲醇超声提取桔梗粉末，制备供试品溶液。对照品溶液为桔梗皂苷D 对照品溶解于甲醇中配成0.4mg/ml的溶液。将对照品溶液和供试品溶液用0.45m的滤膜过滤后取10l进行测定。色谱条件：C18柱（250 mm4.6 mm）；柱温：25；流动相：乙腈：水：2%磷酸（28：57：15）；流速：1.0 ml/min；检测波长：210 nm；柱温：25。得出以山东淄博所产桔梗中桔梗皂苷D含量最高。同时作者还用该法测定了桔梗不同部位中桔梗皂苷D的含量，结果为韧皮部含量最高，其次是根部、木质部、芦头和栓皮，为桔梗的研究提供了依据。 在高效液相色谱法测定桔梗皂苷含量的基础上，李凤喜等人16采用反相高效液相色谱法测定桔梗皂苷的含量。首先称取桔梗皂苷D对照品加甲醇配成150l/ml的对照品溶液，用乙醇超声提取法制备供试品溶液，二者均过0.45m滤膜过滤。在流动相为乙腈0.02mol/L磷酸氢二钾，流速0.7 ml/min，检测波长206nm的条件下测定桔梗中桔梗皂苷D的含量。桔梗在0.01500.1496 mg范围内有良好线性关系，r=0.9999，加样回收率为100.91 %。该方法灵敏、方便，可作为控制桔梗质量的一种方法。 夏泉等17人使用高效液相色谱的的方法首次建立了桔梗皂苷E 的含量测定方法。对照品溶液为桔梗皂苷E对照品的0.4mg/ml甲醇溶液，并用甲醇提取制备供试品溶液,过0.45m滤膜过滤备用。色谱条件为：waters nova-pak C 18柱(3.9 mm300 mm，4 m)；柱温：室温。PDA检测波长190400 nm。漂移管温度为112 。流动相：乙腈水，流速1.0 ml/min，进样量为20l。在不同配比的流动相下梯度洗脱。结果表明桔梗皂苷E浓度在121.8974.4 mg/L范围内线性关系良好，r=0.9997,且加样回收率为98.7 %。桔梗皂安徽大学细胞生物学精品课程 6苷E的含量测定方法研究不多，作者将测定含量D的方法加以改变应用于皂苷E的测定上，本法特点为简单、快速、重复性好，可作为桔梗皂苷E含量测定的方法之一。 3 展望 综上所述，作为我国的传统中药，桔梗因其疗效显著，药理作用明显，分布广泛，从而受到了越来越多的关注。随着大孔吸附树脂、超临界萃取等分离技术的发展和广泛应用，桔梗总皂苷的分离越来越快速、经济，而纯度得到进一步提高；而色谱技术的发展也使桔梗皂苷的含量测定方便、准确。中药有效成分的提取和深加工是我国中药的新出路，也是解决我国部分中药资源不足问题的理想途径。在了解中药有效成分的同时，还需结合化学工艺进行有效成分的人工合成，并不断优化合成途径，探索出适于大规模工业化生产的方法，这样才可有效解决我国中药资源短缺的问题。桔梗有效成分的分离和确定以及所含成分的药理作用，还需进一步深入的研究。 参考文献 1 国家药典委员会编.中华人民共和国药典(一部)S.2005年版.北京：化学工业出版社,2005,196.  2 付文卫,窦德强,裴月湖.桔梗的化学成分和生物活性研究进展J. 沈阳药科大学学报,2006,23(3):184-191. 3 孙远志,何树东.桔梗对呼吸系统疾病临床应用概况J.内蒙古中医药.2006,6:58-59. 4 杨 壮,田景奎,张 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