westernblot详解及问题分析

p蛋白质免疫印迹技术及蛋白质免疫印迹技术及p常见问题分析常见问题分析张绍进Western Blotq Western Blot 简介简介q Western Blot 一般流程一般流程q Western Blot 常见问题分析常见问题分析Western BlotWestern Blot 简介：p 印迹法（ blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。p 1975年， Southern建立了将 DNA转移到硝酸纤维素膜（ NC膜）上，并利用 DNA RNA杂交检测特定的 DNA片段的方法，称为 Southern印迹法。p 而后人们用类似的方法，对 RNA和蛋白质进行印迹分析，对 RNA的印迹分析称为 Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为 Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为 Eastern印迹法。Western BlotWestern Blot 基本原理基本原理Western BlotWestern Blot 优点优点p 高分辨率的电泳技术p 特异敏感的抗原 -抗体反应p 1-5ng中等大小的靶蛋白Western BlotWestern Blot应用应用q 目的蛋白的表达特性分析q 目的蛋白与其它蛋白的互作q 目的蛋白的组织定位q 目的蛋白的表达量分析Western BlotWestern Blot 流程流程l蛋白样品的制备SDS-PAGE转膜封闭一抗杂交二抗杂交底物显色Western Blot? 通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白 水溶液提取法水溶液提取法针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂最常用的溶剂 。 有机溶剂提取法有机溶剂提取法对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。包括乙醇、丙酮和丁醇等。? 通过层析或电洗脱法制备目的蛋白通过层析或电洗脱法制备目的蛋白蛋白样品的提取蛋白样品的提取Western Blot蛋白样品的定量蛋白样品的定量 目前常用比色法测定样品蛋白的含量：目前常用比色法测定样品蛋白的含量： Bradford法（考马斯亮蓝法）、法（考马斯亮蓝法）、 Lowry法（法（ Folin-酚试剂法酚试剂法）、）、 BCA法等。但各有优缺点，大家可以根据具法等。但各有优缺点，大家可以根据具体情况选取。按相应蛋白质定量试剂盒操作说明体情况选取。按相应蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。操作，测定样品浓度。 蛋白质浓度测定的各种方法汇总：蛋白质浓度测定的各种方法汇总：/thread-23639-1-1.htmlWestern Blot蛋白样品的变性蛋白样品的变性p 2SDS-PAGE上样缓冲液：p DTT可临用前以 1： 4比例混合加入，亦可全部配好分装， -20 冻存。p 按 1:1比例与蛋白质样品混合， 95 100 加热 5 15min，冰上冷却后再上样，上样量一般为 20-25l，总蛋白量 2050g。1M Tris-HCl(pH6.8) 10 ml1M DTT 20 mlSDS 4 g甘油 20 ml溴酚 蓝 0.2 g总 体 积 100ml 100mM Tris-HCl(pH6.8) 200mM DTT 4%SDS 0.2%溴酚兰 20%甘油 ddH2OWestern BlotSDS：p 阴离子去污剂 变性剂p 氨基酸侧链与 SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质 -SDS胶束。p 蛋白质 -SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不 同分子之间原有的电荷差异。p 与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线性化。Western Blot蛋白质 -SDS胶束的特点：（ 1）具有相同的形状，形状像一个长椭圆棒（ 2）平均 1g 蛋白质结合1.4g SDS（ 3）短轴对不同的蛋白质亚基 -SDS胶束基本上是相同的（ 4）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比Western Blotq 不连续的电泳缓冲体系。q SDS 蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳Western Blotp SDS-PAGE 是在蛋白质样品中加入 SDS和含有巯基乙醇的样品处理液， SDS是一种很强的 阴离子表面活性剂阴离子表面活性剂 ，它可以断开分子内和分子间的氢键断开分子内和分子间的氢键 ，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。p 强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇， DTT） 可以 断开二硫键破坏蛋白质的四级结构 。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与 SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质 -SDS复合物。p 蛋白质分子结合 SDS阴离子后，所带负电荷的量远远超 过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所 带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基 的相对分子质量，而与其所带电荷的性质无关。【 SDS-PAGE基本原理基本原理 】Western Blot凝胶成分M 丙烯酰胺和 N,N- 亚甲双丙烯酰胺 M SDSM 配胶的 Tris缓冲液M TEMEDM 过硫酸铵M Tris-甘氨酸电泳缓冲液Western BlotPAGE：聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶 (polyacrylamide gel)是由单体丙烯酰胺 (acrylamide，简称 Acr)和交联剂 (crosslinker)N,N-亚甲基双丙烯酰胺 (N,N-methylenebisacylamide，简称 Bis)在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。化学惰性强，具有一定的机械强度和透明度。是良好的电泳介质。Western Blot聚丙烯酰胺凝胶的聚合方式： 单体：丙烯酰胺（ Acr）； 交联剂：甲叉双丙烯酰胺（ Bis）； 催化剂：过硫酸胺或核黄素（ AP）； 加速剂：四甲基乙二胺（ TEMED）； 产物：三维网状结构凝胶 聚丙烯酰胺凝胶聚合机理是通过提供氧游离基 (free radicals)的催化，使体系发生氧化还原作用 (catalyst-redox systems)来完成的。催化体系主要有化学催化（ AP TEMED）和光化学催化（核黄素 TMTED）体系。Western Blot凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度（） 线性分离范围（ KD)15 12-4310 16-687.5 36-945.0 57-212SDS-PAGE浓缩胶 (5% Acrylamide)及分离胶配方表： /thread-20726-1-1.html Western Blot不连续电泳：作用 缓冲液 PH 凝胶浓度浓缩胶 使蛋白样品浓缩 pH6.8Tris-Cl低， 2-5%分离胶 使蛋白样品分离 pH8.8Tris-Cl高，根据蛋白大小电泳缓冲液： pH8.3 Tris-甘氨酸系统 。Western Blot灌制分离胶 隔绝空气ddH2O0.1%SDS:8%Western Blot灌制积层胶 插入梳子 Western BlotStaking gelSeparating gelWestern Blot转膜p 要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如 NC膜）上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法 。p 常用的电泳转移方法有 湿转和半干转 。两者的原理完全相同，只是用于固定胶 /膜叠层和施加电场的机械装置不同。 Western Blot转移膜的选择转移膜的选择p 最常用于 Western Blot 的转移膜主要是硝酸纤维素（ Nitrocellulose， NC）膜和聚偏二氟乙烯 （ Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜，此外也有用尼龙膜、 DEAE纤维素膜做蛋白印迹。尼龙膜和 NC膜的特点相似 ,主要用于核酸杂交。p 各种膜的详细特点介绍：p /bio101/2008/21461_2.htmWestern Blot湿转系统Western Blot半干转移系统Western Blot丽春红染色丽春红染色蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜，换水几次。印度墨汁染色印度墨汁染色只用于放射性标记抗体或放射性标记 A蛋白探针的 Western印迹过程。 转膜后检测（此步可以省略）转膜后检测（此步可以省略）Western Blot封闭封闭S 为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜发生非特异性结合，使非特异性背景提高，发生非特异性结合，使非特异性背景提高，需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理。需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理。S 5%脱脂奶粉或脱脂奶粉或 BSA（室温孵育（室温孵育 1h）S Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司）膜封闭液（生物试剂公司）S Tween-20的作用：减少非特异性吸附，不影的作用：减少非特异性吸附，不影响抗体与抗原的结合。响抗体与抗原的结合。Western Blot一抗、二抗孵育p 把 NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据膜面积以0.1mL/cm2的量加入一抗溶液，摇床上平缓摇动，于室温孵育