MALDITOFTOFMS在蛋白质组研究中的应用ppt课件

MALDI TOF/TOF MS在蛋白质组研究中的应用1报告内容：一、蛋白质组学简介二、生物质谱用于蛋白质组鉴定的基本原理三、 MALDI TOF/TOF MS仪器组成和基本原理四、 MALDI TOF/TOF MS在蛋白质组研究中的应用1、在表达谱构建中的应用2、在翻译后修饰研究中的应用3、在蛋白质相互作用研究中的应用4、在蛋白质相对和绝对定量研究中的应用2一、蛋白质组学简介蛋白质组（ proteome）： 一种细胞、组织或生物体完整基因组所对应的全套蛋白质。蛋白质组学（ proteomics)： 研究细胞、组织或生物体中蛋白质组成、定位、变化及其相互作用规律的科学。简要历史回顾：1994年，澳大利亚的科学家首次提出蛋白质组概念；1995年，蛋白质组一词首次见诸报端；2001年 4月，在美国成立了国际人类蛋白质组研究组织 (Human Proteome Organization, HUPO)，随后欧洲、亚太地区都成立了区域性蛋白质组研究组织，期望共同努力，完成人类蛋白质组计划 (Human Proteome Project)；另外，创刊了蛋白质组学专门杂志，如 Proteomics 、 Molecular & cellular proteomics 和 Journal of proteome research ；2002年现在，已举行了六届 HUPO国际会议和五届中国蛋白质组学术大会。 3蛋白质组研究的意义1、一些物种如小鼠、大鼠等基因组测序工作的完成，特别是人类基因组计划草图完成（ 2001年 ）后，人们面临的迫切任务之一便是对基因组的功能注释，而在基因组和转录组水平上常常无法回答许多生物学问题，如基因转录和翻译的起始位点、翻译后修饰种类和位点、定位信息以及相互作用等问题，因此，蛋白质组的研究是基因组研究的深入和延续；2、作为生命功能的执行体 蛋白质组的研究是为了从更高层次上深入解读生命的本质和生命活动的规律。3、通过人类疾病蛋白质组的研究，为病理研究、早期诊断、治疗以及药物开发提供依据。4蛋白质组学研究的内容1、蛋白质组表达谱 (proteome expression profiling)针对已有基因组或转录组数据库的生物体、组织或细胞，建立相应蛋白质组或亚蛋白质组数据库。2、蛋白质组修饰谱 (proteome modification profiling)构建蛋白质翻译后修饰的种类、修饰位点以及修饰官能团的结构等数据库。3、基本生物学问题研究与生命活动过程中密切相关的问题。比如：蛋白质组成和空间结构、定位和相互作用网络等；54、临床应用问题以重要的生理过程或人类一些重大疾病为对象，进行重要的生理和病理体系或过程的研究，即进行比较蛋白质组学研究，包括疾病发生和发展机制、疾病诊断标志物以及药物靶标等；5、蛋白质组学中的新技术和新方法建立蛋白质组学研究的支撑技术平台以及生物信息学研究工具，包括各种定性、定量、结构分析和生物信息学软件和数据库。6蛋白质组研究中的复杂性一种细胞、组织或生物体有多少蛋白质 ? 人类基因组含有 34万个基因，与小鼠的基因数相差不多，仅是果蝇或线虫的两倍左右，但他们的表型相差却如此巨大，其根本问题便是蛋白质组的差异所致。30000-40000个基因 30000个基 因共享 99%基因7Post translated modificationInteractionConformation transformationPost translated splicingDisplacementcytoplastnuclei蛋白质多样性一个基因表达多少种蛋白质？8对于对于 人体：1个受精卵发育成 1012细胞， 103细胞类型。其 “蛋白质组 ”随 “时 ” 、 “空 ” 处于变化之中，而 “基因组 ”则相对处于不变之中。因此，我们可以得出： 生命体的统一性源于基因组，生命体的复杂性源于蛋白质组。9主要研究策略1、研究基础（ 1）生物学的发展，特别是越来越多生物基因组测序的完成，为我们提供了蛋白质组数据库；（ 2）生物质谱和分离科学的进步为我们提供了分离和鉴定的技术平台和必须的手段；（ 3）计算机技术的提高，特别是生物信息学的发展为我们处理海量数据提供了有力的支持和保障。102、蛋白质组学研究方法分类（ 1）蛋白质组定性分析依据分析对象是整体蛋白质混合物或酶切后的多肽混合物，蛋白质组的定性分析方法分为 自下向上法 （ bottom up）和 自上向下法 (top down)；依据蛋白质的序列特征，蛋白质组定性分析方法可分为：肽质量指纹谱法 （ PMF)和 肽序列标签法 （ PST,也叫 de novo法 ） 11（ 2）蛋白质组定量分析方法 直接进行比较，包括 SDS-PAGE、 2DE、 HPLC； 标记方法，包括同位素标记亲和标签（ ICAT， iTRQA）、 元素标记亲和标签（ ECAT）、酶促 18O标记、 DYGE技术和同位素氨基酸细胞培养标记 (SILAC)。 123 蛋白质组研究方法进展(1)复杂蛋白质组体系目前对于组织、细胞和血浆等复杂蛋白质组的分析，均采用多维分离技术与质谱联用的方法。其技术路线如图 1和图 2所示。 13细胞、组织或体液蛋白质提取液整体蛋白质混合物预分离包括：2DE， 2DLC，或 LC-SDS-PAGE等不同馏分或蛋白质电泳带多肽混合物溶液酶切或胶上原位酶切PMF， PST OR DE NOVO 数据蛋白质组MALDI MS or MSMS or cLC-ESI- MSMS 生物信息学工具图 1 整体蛋白质组预分离分析技术路线超声、离心处理或亚细胞器分级14细胞、组织或体液蛋白质提取液多肽混合物PST OR DE NOVO 数据蛋白质组MALDI MSMS or c2DLC-ESI- MSMS 生物信息学工具图 2 多维蛋白质组分析技术（鸟枪法蛋白质组学方法） 超声、离心处理或亚细胞器分级溶液酶切15Benjamin F. Cravatt, Gabriel M. Simon & John R. Yates III, The biological impact of mass-spectrometry-based proteomics. NATURE, Vol 450:991-1000 ( 2007)A. J. Link, J. Eng D. M. Schieltz, E. Carmack, G. Mize, D. R. Morris, B. M. Garvik, J. R. Yates, III, Direct analysis of protein complexes using mass spectrometry, Nature Biotechnology 17, 676-682 (1999)（ John R. Yates III， The Scripps Research Institute ）鸟枪法蛋白质组学方法可形象图示为 :16(2) 简单的蛋白质组体系对于特定的、简单的蛋白质组分析，既可采用多维分离技术与质谱联用的方法，也可以采用较少步骤的分离和质谱联用技术。其技术路线如图 3所示。17细胞或组织蛋白质提取液整体蛋白质混合物分离SDS-PAGE， IEF， HPLC不同馏分或蛋白质电泳带多肽混合物溶液酶切胶上原位酶切PMF， PST OR DE NOVO 数据蛋白质组MALDI MSMS, cLC-ESI- MSMS 生物信息学工具图 3 特定或目标蛋白质组分离分析技术超声、离心处理或亚细胞器分级18(3) 数据标准 为确保蛋白质组数据的可靠性，以 Molecular & Cellular Proteomics 为代表的蛋白质组学专业杂志对蛋白质组数据产出、处理、质量控制和发表提出了严格的要求，具体包括：实验方法、数据处理程序名称和版本、蛋白质数据库和版本、数据判断的阈值和统计方法、蛋白质的名称、序号和覆盖率、肽段的序列和分值等。另外，数据可靠性评价标准：如概率法、反转数据库法等评价方法已获得广泛应用。19(4)、蛋白质组技术方法发展趋势蛋白质组研究中目前面临的技术挑战主要是：标准化方法的验证以及数据的精确性和重现性、简便有效的验证技术和定量技术。就技术本身而言仍然是分析化学的基本问题即选择性、准确性、灵敏性、重现性、可行性和动态范围。具体包括：1、 标准化、高灵敏度和高重现性的微量蛋白质组学分析方法的建立及验证和评价体系；2、 “鸟枪 ”蛋白质组学方法向 “导弹 ”蛋白质组学发展，即基于中心法则和转录组数据，直接鉴定相关蛋白质组，而不是随机鉴定蛋白质组；20“鸟枪 ”蛋白质组学方法基于肽段水平上 “随机 ”捕获肽段，籍此对其相应的蛋白质进行鉴定，其结果具有不确定性、不具有目标性以及低的重现性；而 “导弹 ”蛋白质组学发展，即基于中心法则和转录组数据以及文献数据，直接鉴定相关蛋白质组，其结果是具有明确的目标性、高的重现性和鉴定效率。“鸟枪 ”蛋白质组学方法就像在大海中捞鱼，如图 A，而“导弹 ”蛋白质组学方法就像导弹打卫星，如图 B所示。21图 B “导弹 ”蛋白质组学方法示意图图 A “鸟枪 ”蛋白质组学方法示意图22肝组织 蛋白质混合物酶切多肽混合物SCX RPLC二维色谱分离MS/MS Collision CellMS1P1P2P3PnMS1P2P9P5PmSHOTGUNMISSILESHOTGUN:不确定性、不具有目标性以及低重现性MISSILE:明确的目标性、高重现性和高鉴定效率233、规模化高灵敏度、高重现性和宽动态范围的蛋白质组定量方法的建立与科学合理的新算法；4、蛋白质组功能模块定量、动态、实时检测、成像和标识技术的建立和应用；5、集成物理、化学和信息技术中的标记技术、示踪技术、传感技术和成像技术，建立动态目标蛋白质组的表达、修饰、定位和相互作用可视技术；6、建立生物标志物发现、 MRM验证定量和临床标志物检测的标准化方法。24二、生物质谱用于蛋白质组鉴定的基本原理自从 1912年， Thomson首次使用 抛物线质谱仪 测定了 Ne的两种同位素 22Ne和 24Ne以来，经过近 100年的发展，质谱在其各个方面都得到巨大的发展（如下图所示）， 各种组合的质谱仪不断出现，应用更加深入广泛！真空系统进样系统 离子源离子源 质量分析器检测器供电系统 数据处理与控制系统25离子源离子源的作用： 将样品中的原子、分子电离成为离子，并使这些离子在离子源系统中形成具有一定几何形状和一定能量的离子束，然后进入质量分析器被分离。有机质谱常用的离子源有：电子轰击离子源（ EI）；对热不稳定或高分子量化合物有化学电离源（ CI）；解吸化学电离源（ DCI）；场电离源（ FI）；场解吸电离源；快原子轰击电离源（ FAB）；离子轰击电离源（ IB）； 激光解吸电离源（ LI）；热喷雾和电喷雾电离源（ ESI） 等。生物质谱常用后两种离子源。26质量分析器质量分析器的作用：使离子按照质荷比的大小分离开来，以便得到按质荷比大小顺序排列成的质谱图。有机质谱和生物质谱常用的质量分析器有： a 磁场 (或电场 )质量分析器； b 四极杆质量分析器； c 飞行时间质量分析器； d 离子阱质量分析器； e 离子回旋共振质量分析器； f ORBITRAP （轨道离子阱）。27质量分析器、缩写符号和原理28生物质谱用于蛋白质鉴定的基本假设：（ 1）蛋白质的组成是唯一的，即 蛋白质具有一个、数个肽段或一组肽段作为其标签；（ 2）存在选择性地对蛋白质进行酶切的一种或多种蛋白酶；（ 3）通过生物质谱获得的肽段的质荷比信息可以推测