蛋白组学定量蛋白质组学 ppt课件

蛋白质组学1第四章 定量蛋白质组学Quantitative proteomics定量蛋白质组学，就是把一个基因组表达的全部蛋白质或一个复杂混合体系中所有的蛋白质进行精确定量和鉴定的一门学科。2n 蛋白质组学的研究目的是以大规模的尺度研究细胞蛋白质的功能。n 依靠 2-DE和质谱技术，蛋白质组的研究策略和方法在细胞蛋白质的鉴定上已经比较成熟。n 但是仅仅进行鉴定并不能提供用以阐明蛋白质的功能的全部信息，监控蛋白质的表达水平对阐明细胞体内存在的各种生物进程是非常重要的。因此，定量蛋白质组学作为蛋白质组学研究的重要一部分被提出来。 3常用研究方法n 以质谱技术为基础的化学标记定量方法 n 荧光差示双向凝胶电泳技术（ F 2DDIGE）4化学标记定量n 对具有相同离子化能力的蛋白质或多肽，通过比较质谱峰的强弱，可以得到其相对量的数值。n 用一种质量标签来标记一种状态下的蛋白质，与另一种状态下没有标记的蛋白质混合起来，进行质谱分析，然后比较某个蛋白质没有标记的峰和标记后峰的强弱，就可知道该蛋白质在这种状态下表达量的变化。n 常用的是在样品中加入包含稳定的重质同位素 (2H、13C、 15N、 18O、 35S) 试剂 , 与被分析物结合而被标记，通过质谱检测以确定其蛋白质的表达水平。5标记方法n 体内标记n 15N体内 代谢标记 n 稳定同位素标记的 必需氨基酸 体内标记(SILAC法 ) n 体外标记n -NH2氨基标记 n COOH羧基标记 n -SH巯基标记 ICAT策略 6（一）体内代谢标记方法n 培养方法：将两种细胞样品分别置于正常培养介质（ 14N）和富含某重质同位素（ 15N）的相同培养基中培养。 n 蛋白质提取：培养一定时期后，将两者混合，然后破细胞，提取相关部位感兴趣的蛋白质，进行消化酶解。n 鉴定：通过选择性亲和分离、色谱分离等过程，最后进行质谱分析。每一对分析肽段与内标肽段在得到的 质谱图 中表现为一对峰，峰的间距等于肽段中所含的氮原子的个数。7酿酒酵母 G1细胞周期蛋白 Cln2的影响：cln2: 14NCLN2: 15NA: 翻译延伸因子 1a cln2 : CLN2 1： 0.93B： 磷酸丙糖异构酶（ Tpi1）代谢标记典型质谱图8体内代谢标记法具有较好的稳定性和重复性915N体内代谢标记也可以定量位点特异的化学修饰n 磷酸化修饰定量：n X：未被磷酸化的肽段n Xp：被磷酸化的肽段n X被磷酸化成 Xp后分子量会增大，在 MS图谱上峰会迁移10特点n 代谢标记方法比较准确和稳定 ,可以检测蛋白质在 pmol浓度内的 20的量的变化。n 不能直接用于组织样品的分析。n 同位素试剂需要量较大，成本高。n 相同肽段的不同同位素标记形式之间的质量变化依赖于氮原子数目，因此对未知的蛋白质难以进行定量。 11（二） 稳定同位素 标记的 必需氨基酸体内 标记 (SILAC法 ) n 高等动物细胞的生长中需要一些必需氨基酸的摄入，如赖氨酸(Lys)、亮氨酸 (Leu)、苯丙氨酸 (Phe)等，这些氨基酸细胞自身无法合成，需要从外界摄入补充。 n 在培养细胞时，可以在培养介质中特异的加入用稳定同位素标记的某一种必需氨基酸，在经过适当的培养时间后，细胞中合成的含有这类氨基酸的蛋白质几乎都掺入了标记的氨基酸 。n 收获不同同位素标记的不同生长状态下的细胞，混合裂解，再做质谱，就可以从质谱图上得到蛋白质差异表达量的信息。 n 这种蛋白质定量策略称为 SILAC (Stable Isotope Labeling By Amino Acids In Cell Culture，细胞培养物中含有稳定同位素的氨基酸标记 ) 12SILAC法 : 鼠肌肉细胞分化过程中蛋白表达量变化Leu-d0 Leu-d3(L-leucine-5,5,5-D3)Leu被标记：丰度最高氨基酸13Leu-d3可被细胞吸收肽段： VAPEEHPVLLTEAPLNPK，带 3个电荷143-磷酸 -甘油醛 -脱氢酶表达变化15n 用 Lys来标记明显好于其他的必需氨基酸，n 因为当用胰蛋白酶 (Trypsin)酶切时，n 保证了含有 Lys残基的每个肽段都只含有一个标记物n 避免了未知肽段用 15N标记所带来的质量变化不清的类似问题n 有利于蛋白质做 MS/MS鉴定时质谱图的解析16体内标记和体外标记比较n 总的来说，体内标记相对于体外标记方法来说具有一些自身的优势 n 省去了标记化学反应和分离纯化等步骤，因而减少了样品的损失 n 有利于低丰度蛋白质的高灵敏度检测 n 体内标记也存在一些缺点 n 培养细胞在富含稳定同位素的介质中生长，这些介质可能会影响细胞的繁殖和其他生物进程，由此改变蛋白质的表达水平 n 这种方法受到同位素材料成本的限制，不可能整个动物体进行标记 n 对于未知序列肽段，大多数的体内标记都无法确定标记物与肽段之间量的关系，从而使得我们难以确认同一肽段在质谱图上成对出现的不同同位素标记形式 17体外标记常用方法n -NH2氨基标记n COOH羧基标记 n -SH巯基标记 ICAT策略18 NH2标记（ d0/d3 、 d0/d4 法）n 多肽的 N末端和 Lys残基侧链上是 -NH2基团，容易跟含有 酰氧基 的小分子如琥珀酸酐、 N-乙酰氧琥珀酰亚胺等发生 酰基化反应，从而对肽段进行标记。n 采用一种正常的酰基化试剂与分别含 3个（ d0/d3）、 4个氘原子（ d0/d4） 的氘代酰基化试剂标记酶解后的多肽体系。该类试剂可与肽的 N-端氨基 发生稳定的酰基化反应，还可与肽中赖氨酸的 -氨基 反应。n 当某肽段中不含赖氨酸时，分析物与内标物的质谱峰对分别相差 3和 4个质量单位，被分析肽段中每增加一个赖氨酸残基，该质谱峰对的差距就分别增加 3和 4个质量单位。19d0/d3标记蛋白质 N末端原理n N-乙酰氧基琥珀酰亚胺 (N-Acetoxysuccinimide )n 三氘代 N-乙酰氧基琥珀酰亚胺 (N-acetoxy-D3succinimide )20MALDI-TOF /MS 分析 N末端乙酰化肽段1195.6126 1198.641821MALDI -TOF/MS 分析 N末端和 Arg的 NH2乙酰化肽段1574.7610 1580.762422E.coli 半乳糖苷酶蛋白水平半乳糖苷酶蛋白表达量可被诱导表达提高到 2.5倍诱导表达： 1H3标记未诱导表达： 2H3标记23d0/d4标记蛋白质 N末端原理n H4-Nic-NHS1-(H4-烟酰氧基 )琥珀酰亚胺 n 四氘代 H4-Nic-NHS1-(H4-烟酰氧基 )琥珀酰亚胺 24MALDI-TOF mass spectrum of a peptide labe