基因组DNA分析PPT课件

基因组基因组 DNA分析分析实验一实验一 高分子量高分子量 DNA的提取和纯化的提取和纯化1一、原理n DNA是染色体的组成成分，遗传的物质基础n 研究遗传、疾病发生的基础n 研究的前提： DNA的提取1、破细胞 -SDS破坏细胞壁2、去蛋白 -苯酚（蛋白变性剂）3、除 RNA-RNAase2n 原理：用蛋白酶 K及 SDS在 EDTA存在的条件下，裂解细胞、消化蛋白质，使核蛋白解聚、细胞内存在的 DNA酶失活，酚 -氯仿有机溶剂多次抽提以后，用透析或乙醇沉淀得到纯化的DNA3二 . 提取 DNA的总原则：1、保证核酸一级结构的完整性a.防止机械剪切力损伤 DNAb. DNase降解 DNA2、排除其它分子的污染a.样品不纯，失去抑制酶作用（有机溶剂、高浓度的金属离子）b.蛋白质 /糖 /脂的污染降到最低c.DNA中无 RNA3、保持核酸的生物学活性避免过酸过碱 4保证高分子量 DNA的完整性n 影响因素： 物理因素：机械剪切力 -牵拉 DNA损伤，对化学键破坏， DNA断裂 化学因素：过酸过碱 -DNA变性 生物因素： DNA酶 -DNA降解n 操作注意事项： 物理因素：避免机械剪切力 -钝口滴管，动作轻柔 化学因素：防止过酸过碱 -保证温和条件 pH4 10（ pH8.0） 生物因素：抑制 DNA酶 -低温、使用 EDTA5保证高分子量 DNA的纯度n 使用方法： SDS-Proteinase K-EDTAn （ 1） SDS：十二烷基磺酸纳（硫酸纳） -离子型表面活性剂主要功能： 1.溶解细胞膜上的脂质与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。2.解聚细胞中的组蛋白：将 DNA从核蛋白上拆下来，打开二硫键。3.SDS能与蛋白质结合成为 R-O-SO3-R+-Pro的复合物，使蛋白质并行而沉淀下来，故对酶有抑制作用。n （ 2）蛋白酶 K：主要功能： 1.蛋白水解酶活性 -广谱蛋白酶，在 SDS、 EDTA存在下保持很高的活性。2.将蛋白质降解成肽或小片段的氨基酸。n （ 3） EDTA：乙二胺四乙酸主要功能：金属离子的弱螯合剂，抑制 DNase的活性。6操作注意事项1.为尽可能避免 DNA大分子的断裂，在实验过程中必须： (1) 匀浆时应保持低温 (冰浴中 )，匀浆时间应短 (30s次， 2次，勿用玻璃匀浆器(2) 实验中使用的吸取 DNA水溶液的滴管管口需粗而短，并烧成钝口(3) 苯酚 -氯仿抽提时 勿剧烈振摇2.保持 DNA活性，避免酸、碱或其它变性因素使 DNA变性3.苯酚 是一种强烈的蛋白变性剂。实验时， 应戴手套操作 ，避免碰到皮肤，以免灼伤。苯酚蒸汽毒性较大，实验中应注意将盛 苯酚的试剂瓶盖好 （防氧化 -8-羟喹啉）4.移液枪的使用7实验操作（ 1）：20%SDS 25ul ；EDTA 30ul；PK 20ul+等体积 酚：氯仿10000rpm， 5min鼠肝匀浆液1/3匀浆液水相轻缓混匀塑离刻离+2.5V冰 ETOH；0.1MNaCl沉淀 +1mlTE溶解白色絮状沉淀+70% ETOH洗+RNase20ul3730min50 30min+等体积 酚：氯仿塑离轻缓混匀10000rpm， 5min水相+2.5V冰 ETOH；0.1MNaCl刻离+颠倒混匀8白色絮状沉淀Precipitated DNA molecules appear as long pieces of fluffy, stringy, web-like strands.9实验操作（ 2）：沉淀加 0.3-0.5mlTE溶解白色絮状沉淀+70% ETOH洗比色定量余原液 PCR取 100ul稀释成 3ml（ 1： 30）， OD260/OD280比色定性、定量 10n 生物组织： 最好新鲜组织，若不能马上提取，应贮存 70 或液氮 液氮冷冻敲碎研磨 组织匀浆法 液氮匀浆法三 . DNA样品准备11n 酚抽提法 先用蛋白酶 K、 SDS破碎细胞，消化蛋白，然后用酚和酚 -氯仿抽提，最后乙醇沉淀。获 DNA大小为 100 150kb四 . DNA提取12五、 DNA的浓缩n 乙醇沉淀：（ 1）需要阳离子盐的存在 NaCl对含 SDS样品好（ 2）沉淀温度与时间 0 ， 10 15分钟（ 3）离心 小于 100bp DNA需超速离心 :0 4 ， 12000g， 10分钟，13六 . DNA的鉴定n 分光光度法 在 260nm和 280nm处测定 DNA溶液的光吸收，A260与 A280之比应在 1.7 1.80。低于此值表明制备物中留有蛋白质成份或酚。高于此值表明有 RNA的残留量。14DNA纯度鉴定：A260/A280 1.8 1.8 1.8纯酚或蛋白质污染RNA污染15七 . DNA的定量n 分光光度法：测定 DNA在 A260nm的光吸收，计算浓度A260 稀释倍数 50 g/ml (双链 DNA)16DNA浓度（ g/ml ）= A260nm 50 稀释倍数 1/光径DNA的吸收峰在 260nm1 OD相当于 :50 g/ml DNA40 g/ml RNA20 g/ml 寡核苷酸17八 . DNA的贮存n 1. 短期贮存： 4 或 -20 存放于 TE（ tris和 EDTA， pH8）缓冲液中。n 2.